细胞凋亡—流式细胞仪检测

细胞凋亡（cell apoptosis）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡之所以成为人们研究的一个热点，在很大程度上决定于细胞凋亡与临床病毒的密切关系。这种关系不仅表现在凋亡及其机制的研究，阐明了一大类免疫病的发病机制，而且由此可以导致疾病新疗法的出现，特别是细胞凋亡与肿瘤、艾滋病及神经系统的退行性病变之间的密切关系倍受人们重视。

实验原理：

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。下面以检测海马神经元凋亡率为例简单介绍细胞凋亡检测的一般步骤及方法。

具体步骤：

1. 海马神经元单细胞悬液的制备：在各组中取生后第7天、生后第21天的仔鼠各两只，冰浴上快速切取海马组织，用冰冷的D-Hanks液洗2-3次，弃上清，剪碎，加入0.25%胰酶1.0ml，37℃恒温水浴30min，轻轻吹打，加入冰冷的DMEM(含10%(v/v)的小牛血清)3.0ml，终止消化。过200目筛网，滤液以1000r/min离心弃上清，再用冰冷的PBS液重悬细胞。用台盼蓝染色计数活细胞数，细胞存活率应在95%以上，调整细胞浓度至1×105—1×106个/ml之间。

2. 流式细胞仪法检测海马神经元凋亡率：取1ml细胞，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。加入冷的PBS液1ml，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，重复此步骤两次。对于贴壁细胞，先用胰酶消化，再用PBS液洗涤。将细胞重悬于200μl Binding Buffer。本实验中设有四个对照组，分别为：空白对照、FITC对照、PI对照、FITC and PI对照，其余待测样品均加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟（或37℃培养箱中孵育），加入300μl Binding Buffer，在一个小时内上机检测。

3. 检测条件：激发光光栅5nm，发射光光栅10nm，测定温度维持在(37±1℃)，避光。取细胞悬液，以激发波长340nm和380nm，发射波长510nm进行扫描。加入破膜剂10% （V/V）TritonX-100 3μl，测定最大荧光比值(Rmax )，待曲线平稳后加入0.3%EDTA 17μl，测定最小荧光比值(Rmin)。

4. 计算公式：[Ca2+]i =Kd×[(R-Rmin )/(Rmax-R)]×(Fmin/Fmax)，式中Kd = 224nmol/L，R为F340与F380的基线荧光强度比值，Rmax为加入10%Triton X-100后测得的F340与F380的最大荧光强度比值，Rmin为加入0.3%EDTA后测得的F340与F380的最小荧光强度比值，Fmin为最小荧光强度比值时F380的荧光强度，Fmax为最大荧光强度比值时F380的荧光强度。

注意事项：

1. 必须活细胞检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。

2. 特殊细胞的染色方法：在消化或吹打时，有些细胞（如神经元细胞）很容易受到损伤，导致晚期凋亡或坏死比例非常高，不能反映真实结果。实验的解决方法：先低速离心，吸取细胞培养板中的液体，留少许液体，加入适量PI和Annexin-V染色10min后，将漂浮细胞吸至离心管中，离心洗涤两次，用PBS漂洗贴壁细胞两次，加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中，离心洗涤，再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例，增加早期凋亡细胞比例。

3. 由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大，因而在消化细胞时，建议一般不采用含EDTA的消化液。

4. 必须设置阴性对照和补偿对照（分别单染）。