人-结肠肿瘤细胞悬液制备

注 | 以上操作指南中涉及的消化酶以及实验方法仅供参考，实际应用过程中请根据具体情况进行细节上的调整。

背景介绍

结肠是大肠的一部分，主要功能是吸收水分和电解质，将食物残渣形成粪便。结肠组织学结构包括黏膜、黏膜下层，肌层和外膜。黏膜表面光滑无绒毛，上皮为单层柱状，由吸收细胞和杯状细胞组成；黏膜下层则是结缔组织，含成群脂肪细胞；肌层由内环形和外纵行两层平滑肌组成，可形成结肠袋；外膜为浆膜或者是纤维膜。

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。在实验过程中一般通过美天旎的人类肿瘤组织分离试剂盒来获得结肠肿瘤的单细胞悬液。

结肠肿瘤示意图

结肠肿瘤图片

实验仪器及耗材

实验步骤

1. 准备肿瘤解离试剂盒的酶混合液，将100µL的H酶、500 µL的R酶和25 µL的A酶加入到4.4mL RPMI 1640培养基中。
2. 组织切成直径2-4 mm的小块。
3. 将组织转移到含有酶液的gentle MACS C 离心管（冰上）。
4. 拧紧C管，并将其倒挂在gentle MACS 解离器的套管上。
5. 运行gentle MACS解离器中的h_Tumor_01程序。
6. 程序终止后，将C管从gentle MACS解离器上拆下。
7. 使用MACS mix试管旋转器在37℃下连续旋转C管30 min。
8. 将C管倒挂在gentle MACS 解离器的套管上，并运行gentle MACS解离器中的h_Tumor_02程序，随后将C管置于MACS mix试管旋转器上在37 ℃下连续旋转30 min。
9. 程序终止后，将C管从gentle MACS解离器上拆下。
10. 去上清后使用RPMI重悬细胞沉淀，使用置于50 mL离心管上的70 μm滤膜过滤。
11. 用20 mL RPMI 1640培养基冲洗滤膜，收集滤液后300g离心7 min，尽可能去上清液。
12. 使用适当体积的缓冲液重悬细胞，使用台盼蓝血细胞计数仪分析细胞数量和活性。
13. 检测细胞活性，活性在85%以上可用于后续测序实验。

实验结果

注意：结肠组织脂肪含量高，要多清洗，清洗不完全会干扰细胞计数，严重会影响细胞捕获。解离过程中容易结团，一定要充分消化。另外，结肠组织代谢比较旺盛，解离的时间和酶的强度把握不好的话，活率容易偏低，即使合格了最后下机数据可能线粒体偏高。