人—卵巢癌腹水单细胞悬液制备

注 | 以下操作指南中涉及的消化酶以及实验方法仅供参考，实际应用过程中请根据自己的组织样本类型进行细节上的调整。

背景介绍

正常状态下，人体腹腔内有少量液体（一般少于200ml），可以对肠道蠕动起润滑作用。任何病理状态下导致腹腔内液体量增加，超过200ml时称为腹腔积液（ascites）。腹腔积液是中晚期癌症患者的常见并发症之一。

大多数腹水中含有较高比例的CD45+ 细胞，从而导致非免疫和恶性细胞的捕获能力下降。因此，在做腹水的单细胞检测试验时，需要添加一个CD45+ 细胞去除的步骤，以减少CD45+ 细胞的，另外去除的CD45+ 细胞我们也可以回收后进行评估。

腹水示意图

实验仪器及耗材

实验步骤

1. 进行scRNA-seq至少需要200mL腹水，建议收集在4个50mL离心管中。
2. 4℃，500g离心5分钟；在步骤6的表格中记录细胞沉淀的颜色；去上清。
3. 每管用1-5mL的红细胞裂解液重悬细胞，也可以将同一样品混合在一个管子中进行裂解，但不要超过管子的1/3。 eg. 4个5 mL的细胞悬液(总共20 mL)可以在两个50 mL的管中混合，4个1 mL的细胞悬液(总共4 mL)可以在一个15 mL的管中混合。
4. 冰上孵育3分钟。
5. 加入红细胞裂解液两倍的PBS后迅速580g，4℃离心5分钟。
6. 观察离心后沉淀的颜色，如果仍旧是粉色或红色说明红细胞还大量存在，那么重复步骤3到步骤5。记录下红细胞裂解液的体积，处理时间以及颗粒颜色。 注意！红细胞裂解步骤不要重复3次以上，会导致细胞活力的大量损失。

1. 去上清。用20mL PBS重悬细胞。
2. 使用70μm细胞过滤器过滤到50Ml离心管中。4℃操作！
3. 用20mL PBS冲洗细胞过滤器以尽可能获得细胞。4℃操作！
4. 如果样本中免疫细胞与非免疫细胞的比例较大，则需要按照补充中的步骤去除CD45+细胞。
5. 滤液580g，4℃离心5分钟。弃上清，使用含有50μL0.4%BSA的PBS重悬细胞。
6. 使用台盼蓝血细胞计数仪分析细胞数量和活性。
7. 检测细胞活性，活性在85%以上可用于后续测序实验。

制备结果

补充CD45+ 去除

注意！除操作6和11外其它步骤都要在4℃进行！

1. 无红细胞腹水细胞悬浮液，细胞计数。
2. 4℃，580g离心5分钟。尽可能去除上清。
3. 细胞数量少于1000万，加入80μL MACS缓冲液重悬；细胞数量大于1000万个则按每1000万个细胞80μL MACS缓冲液的比例添加。
4. 每80μL MACS缓冲液加入20μLCD45+磁珠。
5. 4℃或者冰上孵育15分钟。
6. 在孵化过程中，灌注 LS 柱：将柱插入 Midi MACS 分离器，用3mL MACS 缓冲液润洗柱子。
7. 孵育结束后（步骤5），每100 μL悬浮液用900 μL预冷的MACS 缓冲液重新悬浮细胞。
8. 4°C ，500 g 离心悬浮液 4 分钟。
9. 尽可能完全去除上清液。
10. 用500 μL 预冷的 MACS 缓冲液中重新悬浮颗粒（最多1亿个细胞）。
11. 将细胞悬浮液使用步骤6处理的LS分离去除CD45+，收集过滤后的溶液进行后续实验。提示：可用3 mL MACS 缓冲液洗涤柱子以提高细胞回收率，冲洗次数不能超过3次。