小细胞肺癌(SCLC)病人的scRNA-seq数据分析

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文章题目：Signatures of plasticity, metastasis, and immunosuppression in an atlas of human small cell lung cancer 期刊：Cancer Cell 日期：October 14, 2021 DOI：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.09.008 数据开源：Raw and processed data from this paper are publicly available on the Human Tumor Atlas Network(HTAN) data portal at （https://data.humantumoratlas.org/）

总体思路

• 先挖掘SCLC肿瘤细胞的特征，再挖掘免疫环境的特征，最后将二者关联起来。
• 对来自21个非小细胞肺癌(SCLC)样本「涉及原位癌与转移癌，治疗与未治疗」、24个肺腺癌(LUAD)样本以及4个癌旁组织样本的155,098个细胞的进行单细胞测序。并对结果进行合并、去除批次效应，鉴定初步的细胞类型(epithelial 上皮细胞, mesenchymal 间充质细胞, lymphoid 淋巴细胞, and myeloid骨髓细胞 cells)。然后进行如下的深入分析

仅概述了本文的单细胞数据分析部分，实验部分及细节部分可参考原文。

1、SCLC的异质性高于LUAD的异质性

首先进一步对上皮细胞再分群，细胞亚类注释：respiratory epithelium呼吸上皮细胞(including alveolar epithelial肺泡上皮细胞 types 1 and 2, ciliated, club, neuroendocrine神经内分泌细胞, and tuft cells) and hepatocytes肝细胞 derived from liver metastases.

然后分别将neuroendocrine and alveolar epithelial type 2-like 细胞类型代表 SCLC与LUAD肿瘤细胞。基于此，在38个上皮细胞亚群中(64301个细胞)，SCLC有25个cluster的55815个细胞；LUAD有5个cluster的7635个细胞（因为LUAD有较高的基质细胞占比）；

结合病人来源分析每个cluster的异质性如何，用Shannon entropy指标表示。该指标越低，表明该cluster越由某个病人占主导，异质性越高；越高，表明平均由多个病人来源组成。

如上图结果可以看出SCLC的Shannon entropy指标低于LUAD，表明具有相对更高的病人异质性。

2、SCLC分子亚型鉴定，为后续深入分析打基础

过去针对SCLC的研究，根据4个driver基因的表达水平，可将SCLC病人归为4个亚型之一。由于单细胞测序的drop-out局限性，作者尝试用neighbor-graph-based方法，从多基因角度计算每个细胞的可能性；然后结合该样本的所有SCLC细胞可能性，综合判断该样本属于哪一种SCLC分子分型。

如上图所示，将21个样本分为14个SCLC-A亚型，6个SCLC-N亚型，以及1个SCLC-P亚型。由于P亚型过少，后续会主要基于前两个亚型进行分析。

3、SCLC-N亚型具有促转移的特征

首先结合临床信息，SCLC-A多为原位癌，而SCLC-N多为转移癌，并且SCLC-N的Shannon entropy指标低于SCLC-A，即异质性高；

其次SCLC-A与SCLC-N的差异分析以及富集分析结果表示 SCLC-A富集细胞周期与DNA修复等通路；而 SCLC-N富集促转移的特征通路。

此外，从基因对共表达的角度来看，SCLC-N细胞的配体-受体作用强度高于SCLC-A细胞（有待验证）

4、SCLC的非异质性亚群具有促转移特征、干性

如上所述，SCLC细胞具有较高的异质性，但这与SCLC具有普遍的低预后共性相矛盾。于是作者从25个SCLC亚群中，如下图所示，发现了cluster22具有最高的Shannon entropy指标（多个病人来源），于是重点关注这个亚群的特征。

首先由于多个病人来源组成，该cluster的SCLC所属亚型难以确定，提示一种未分化的表型特征；

其次这个cluster相对富集转移相关以及神经干细胞通路，其中最上调的基因为PLCG2，它的同源基因PLCG1有研究指出可以促进新陈代谢；结合PLCG2的基因表达，进行共表达分析，相关高表达模块基因富集通路也提示与干细胞特性、促转移信号通路相关。

作者进一步发现PLCG2在转移癌组织中表达水平高。对细胞系的PLCG2基因过表达与敲除实验、以及WB实验都验证了PLCG2基因是这个cluster的关键基因。

再结合病人的生存数据，表明PLCG2基因高表达，以及较高的该cluster占比与病人较低的预后生存时间相关

5、SCLC的免疫微环境(immune TME)低于LUAD

SCLC被认为是一种immune-cold癌症，即目前热门的免疫治疗效果一般；

作者试图分析不同亚型的SCLC免疫微环境是否存在差异，结果发现SCLC-N(或者说NEUROD1阳性)肿瘤亚型是存在较低的免疫浸润水平；

并且进一步发现尽管免疫浸润水平较高的SCLC，免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用水平也较低。

6、SCLC-N与-A亚型的T细胞组成比例存在差异

首先对SCLC的T,Myeloid细胞亚群进行细胞类型注释；

然后使用非负矩阵分解方式(样本细胞类型矩阵=样本表型矩阵 * 表型细胞类型矩阵)鉴定出来30个factor，其中影响T细胞注释的有七个表型相关因素：CD4+ regulatory (Tregs, factor 4), CD4+ conventional (Tconv, factors 19 and 23)，CD8+ exhausted (Texh, factor 7), CD8+ memory (Tmem, factor 12),CD8+ effector (Teff, factor 28), and CD8+ gamma delta T cells(Tgd, factor 29)

根据作者发现SCLC-N表型相对SCLC-A表型含有较低的ratio of CD8+ effector to Treg factor loadings，即含有相对较少的细胞毒性T细胞与调节性T细胞

7、SCLC纤维化相关巨噬细胞亚群鉴定

首先作者对SCLC的myeloid细胞进行重新聚类分群，包含7个 monocyte/macrophage亚群。并且发现其中的4个亚群(1,7,9,12)高表达细胞外基质相关基因；

所以作者尝试比较这4个亚群与 idiopathic pulmonary fibrosis特发性肺纤维化 (IPF)的相似性，其中cluster1、7最相似；具体来说cluster1的促纤维化巨噬细胞基因集特征最像IPF；而cluster7的单核细胞基因集特征最像IPF

8、PLCG2-high SCLC population 与免疫细胞亚群的关联性

在之前发现的一个低异质性SCLC肿瘤细胞亚群(PLCG2-high SCLC population)具有促转移特征，因此作者想分析是否与上述鉴定的profibrotic Mono/Mψ亚群相关。如下图所示的确存在显著的相关性。

此外也发现PLCG2-high SCLC population与T细胞亚群 exhausted CD8+ T cells显著相关，并都从实验角度得到验证

总之，我们的研究结果表明，这种复发性SCLC亚群可能存在于以CD8+ T细胞衰竭为特征的免疫抑制TME和可能与EMT相关的促纤维化、免疫抑制的Mono/Mψ人群中。