The bone marrow microenvironment at single-cell resolution

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文章题目：The bone marrow microenvironment at single-cell resolution 发表期刊：nature 发表时间：2019年4月10日 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-019-1104-8#Bib1

通讯作者是Iannis Aifantis 教授，其研究方主要为Cancer, immunology, stem cell biology, epigenetic regulation, leukemia, tumor microenvironment，实验室主页The Iannis Aifantis Lab[1] ；代表作：

摘要

在本研究中，在体内平衡和应激诱导的造血条件下分别构建了小鼠骨髓血管，血管周围和成骨细胞群的单细胞转录组图谱。该研究揭示了骨髓龛中先前未被认可的细胞异质性水平和阐明了造血生长因子，趋化因子和膜结合配体的细胞来源。我们的研究表明，在压力条件下，包括血管周围细胞的脂肪细胞倾斜在内的骨髓龛的转录重塑相当大。应激条件下，观察到由DIl1和DIl4编码的血管Notch delta样配体基因表达下调。在无血管DII4基因存在的情况下，造血干细胞会过早地诱导髓样特征的转录进程。以上这些发现重塑了人们对骨髓龛细胞结构的认知，揭示对压力极其敏感的动力学和异质性分子图谱，同时表明单细胞转录组数据在评估离散龛细胞群体在造血功能的调节中的效用。

背景

HSC自我更新造血干细胞维持，需要瘦素受体阳性（LEPR +）的间充质基质细胞和血管内皮细胞组成的特化骨髓微环境中。当然也需要成骨细胞支持（早期淋巴祖细胞存活和维持）。交感神经纤维细胞，巨噬细胞，巨核细胞和非髓鞘化施万细胞提供额外的信号（细胞因子），这也有助于HSC龛。前期的研究表明，骨髓结构中存在有血管细胞和间质干细胞介导的更深程度的细胞复杂性。由于骨髓中靶标细胞的数量太少及分离技术的局限性，骨髓微环境的分子异质性和功能可塑性的研究仍然有限。

Transcriptomic profiling of the bone marrow niche

小鼠细胞类群

作者使用谱系特异性的Cre转基因小鼠（tdTomato）与敲入报告基因的Rosa26 locus (LoxP-tdTomato)杂交。产生了标记脉管类细胞的VE-Cad-tdTomato、瘦素受体阳性的细胞LEPR-tdTomato、标记成骨细胞的COL2.3-tdTomato。

小鼠类型，混样测序

• VE-Cad-tdTomato 标记脉管类细胞(pooled n = 3mice, 12 weeks)
• LEPR-tdTomato标记LEPR阳性的细胞(pooled n = 2,12 weeks)
• COL2.3-tdTomato标记成骨细胞(pooled n = 3,16 weeks)

作者没有直接进行单细胞测序，而是先进行了普通的转录组测序。从酶分解消化标记的骨髓中分离出CD45low TER119lowtdTomato+ cells细胞并进行转录组测序(bulkmRNA sequencing), 结果证明存在不同的转录类群。然后才进行单细胞转录组测序。

选择VE-Cad+ , LEPR+ 与COL2.3+ 阳性的细胞进行了单细胞测序，来研究骨髓龛细胞群体的转录组多样性。正常与氟尿嘧啶处理后的小鼠细胞，经过质控和过滤获得 17,374细胞。为了探究骨髓龛的基准转录水平，作者首先选择状态稳定的条件的细胞（n=9622）进行分析。

与组织特异性相关的基因表达可以将骨髓龛细胞分成明显的亚群。

2个内皮、4个血管周围和3个骨细胞系的细胞亚群及一个小的（70个细胞）增殖细胞亚群 (图 1c, d, 扩展图. 1e)。

同时 e图与b图、bulk转录组结果相互印证。

Fig. 1: scRNA-seq analysis of the bone marrow microenvironment at a steady state

内皮细胞亚群

基于整合或者独立的两种方法，从骨髓脉管系统内鉴定出两个主要的亚群。为了获得每个亚群的生物标记，作者分别对每个亚群与其他类群进行差异表分析。窦状毛细血管的分支网络构成骨髓中的大部分血管，而动脉包含相对较少的侧枝并沿着骨干纵向排列。然后是骨髓龛中血窦中的基因鉴定和检测。

窦状毛细血管组成的分支网络构成了骨髓中的大多数血管，而动脉包含相对较少的侧支，并沿着骨干纵向排列14。动脉相关基因在簇V1 (Ly6ahigh)中表达，而正弦信号基因特异性于簇V2 (Stab2high)15(扩展数据图3a中分别为橙色和蓝色)。我们进行骨髓免疫荧光和证实SCA1 Ly6a(编码),CD102(由Icam2编码)和PODXL(由PODXL编码)表达在动脉(扩展数据图3 b, c),而且VEGFR316(由Flt4编码)和CD54表达(Icam1编码)在正弦曲线(扩展数据图3 d)。LAMA1染色专门标记骨髓血管17。与我们的表达数据一致，流式细胞术分析使我们能够结合表面标记物SCA1 (Ly6a)、CD34(由CD34编码)和LY6C(由Ly6c1编码)来识别动脉(扩展数据图3e)。

V1亚群高表达动脉相关的基因Ly6a V2亚群高表达血窦相关的基因Stab2

免疫荧光和流式结果都证明 ：

• 动脉表达SCA1 (encoded by Ly6a), CD102 (encoded by Icam2) and PODXL (encoded by Podxl)
• 血窦表达VEGFR3(encoded by Flt4) and CD54 (encoded by Icam1)

LEPR细胞亚群

鉴于LEPR+细胞群体具有多谱系分化潜能和间充质干细胞活性，该细胞群体的异质性一直是个悬而未决的问题。作者通过综合分析从LEPR+细胞群体中识别出4个明显的簇（P1、P2、P3、P4）。P1 (Mgphigh )和P2(Lplhigh ) 簇表达成脂相关的标记基因。

分析正常组的LEPR+细胞群体有明显的和3个（P1、P3和P4）簇，结合分析处理组得到P2簇（一个成脂前体细胞状态而非一个祖细胞）。P3 (Wif1high) 和P4 (Spp1highIbsphigh)为LEPR+细胞群体中成骨蓄势待发的类群，因为成骨相关的基因的表达水平随着时间日益增高。LEPR+细胞群体表达P3和P4簇的特异性基因标记CD200（由Cd200编码）和CD63（由Cd小梁63编码），该标记主要位于骨部分。

鉴于LEPR+群体的多谱系分化潜能和间充质干细胞活性(通过成纤维细胞集落形成单位的形成来检测)，这个隔间的异质性一直是一个开放的问题18。我们的综合分析确定了LEPR+隔间内的四个聚类(图1c, d, 2b)。聚类P1 (Mgphigh)，特别是P2 (Lplhigh)表达脂肪发生相关的标记(聚类分别在图2b中以红色和绿色表示，扩展数据图4a)。对LEPR+群体的分析仅证实了P1、P3和P4集群的存在(扩展数据图2 e-g)。在应激造血环境下的综合分析显示了一个额外的P2簇(图1d和3b)，这表明一个稳定的前脂肪形成状态，而不是不同的祖细胞。为了验证潜在的生物标志物，我们对LEPR - tdtomato股骨进行了免疫荧光检测，发现鼻窦毛细血管覆盖着LEPR+ESM1+细胞(P1和P2特异性标记)，而干骺端和骨内膜毛细血管则覆盖着LEPR+ESM1−细胞(扩展数据图4b)。集群P3 (Wif1high;图2e中的brown)和P4 (Spp1highIbsphigh;图2e中粉红色)表示骨诱导的LEPR+细胞，因为它们表达的成骨相关基因水平逐渐升高(图2e)。表达P3-和p4特异性标记CD200(由CD200编码)和CD63(由CD63编码)的LEPR+细胞主要定位于骨小梁部分(扩展数据图4c)，这与它们的成骨特征一致。我们发现人类CD45−CD271+骨髓细胞(人类间充质干细胞)19的基因特征与P1和P2簇之间存在很强的相关性(扩展数据图4d)。为了功能测试体外干细胞能力，我们使用表面标记物前瞻性地分离LEPR+亚群(扩展数据图4e)。脂肪细胞偏置的P1和P2 (VCAM1highCD63low)群体在成纤维细胞集落形成单位中显著富集，并占了总LEPR+细胞中成纤维细胞集落形成单位的大部分活性(扩展数据图4f)。

COL2.3+细胞亚群

COL2.3+细胞转录分裂成三个群体(图1c, d, 2c)。O1簇(Col16a1highTnnhigh)表达高水平的骨形成蛋白(由Ostn编码)和血管生成素样2(由Angptl2编码)，以及DEL-1(由Edil3编码)，最近被证明可以调节骨髓生成20(扩展数据图5a中灰色显示的簇)。对COL2.3-tdTomato股骨的免疫荧光分析证实，骨骺中存在一组细胞与tdTomato共同表达o1特异性标记物MMP14(由MMP14编码)(扩展数据图5b)。集群O2 (Fbn1highIgf1high;图5a)表达成骨基因和软骨细胞特异性基因。此前有报道称，肥厚软骨细胞与成骨细胞分化标志物共表达Col10a1 21，簇O2可能代表正在进行成骨转分化的细胞(图1d，扩展数据图5a)。骨髓免疫荧光同样证实了o2相关标记CD9(由CD9编码)与tdTomato在骨骺中共表达(扩展数据图5c)。簇状O3 (BglaphighCar3high)表现出COL2.3 (Col1a1)和成骨相关基因的最高表达，代表成熟成骨细胞(簇状O3在图2c中显示为橄榄绿色，扩展数据图5a)。骨髓免疫荧光证实了tdTomato与生物标志物CAR3(由CAR3编码)的共染(扩展数据图5d)。通过对COL2.3+亚群的独立分析发现了更多更小的聚类。值得注意的是，除了O1、O2和O3亚群，Col1a1还表达于血管内皮细胞(簇C4)、胶质细胞(簇C5)和间质样细胞(簇C6)(扩展数据图2h-j)。

LEPR+骨髓细胞同时产生成骨细胞和脂肪细胞11。由于t-SNE可视化并不能维持分化动力学的整体结构，我们重构了发育轨迹，以推断P1、P2、P3和P4簇的LEPR+细胞与最终分化的骨群体之间的关系(图2d)。伪时间排序揭示了LEPR+细胞状态的转录连续体，其中已知的成脂和成骨标记物上升到该范围的另一端(P1和P2相对于P3和P4)(图2e)。

Fig. 2: Expression of pro-haematopoietic factors by the bone marrow microenvironment

为了在骨髓生态位中寻找增殖细胞，我们评估了细胞周期相关基因(如Mki67)，发现它们局限于簇C(图1d中的洋红色，扩展数据图5e, f)，其中包括我们检查的所有三个生态位群体(扩展数据图5g)。这证实，在稳定状态下，大多数(>99%)的成年骨髓壁龛细胞并不活跃地循环。总的来说，这些研究提供了一个详细的稳态静止骨髓微环境的单细胞分辨率图，这使我们能够揭示每个被检查亚群的细胞异质性。

Pro-haematopoietic factors in the bone marrow niche

接下来，我们检查了促造血因子的表达模式18(图2f)。我们发现，血管细胞表达了最高水平的血管生成素(Ang编码)、delta-like Notch配体(Dll4和Dll1编码)和选择素E (Sele编码)22。值得注意的是，在血管亚群内，动脉簇V1富含SDF-1(由Cxcl12编码)和SCF(由Kitl编码)15。LEPR +集群P1和p2处于除了表达SDF-1最高层(Cxcl12)、现金流量表(Kitl)和IL-7(由Il7编码)23-also代表IL-15的主要来源(由Il15编码)24日IL-34 Il34(编码),csf(由Csf1编码)和BMP-4 (Bmp4编码)25日,以及淋巴细胞化学引诱物CCL-19(由Ccl19编码)和单核细胞化学引诱物CCL-2(由Ccl2编码)26日;这表明脂肪细胞启动的LEPR+细胞代表了骨髓生态位中促造血因子的主要宿主。最后，COL2.3+ O1簇表达WNT5A(由WNT5A编码)——此前已被证明可维持HSC平静27——而簇O2则是IGF-1(由Igf1编码)的主要来源，IGF-1是血液系统恶性肿瘤和B细胞发育的关键因素28。通过提高scRNA-seq的分辨率，我们能够精确定义细胞来源，并勾勒出生态位亚种群中促造血因子的分布。

作者从对管脉细胞亚群分析中，发现血管细胞表达最高水平的血管生成素（由Ang编码），δ样Notch配体（具体地，由Dll4和Dll1编码的那些）和选择蛋白E（由Sele编码）。在管脉细胞亚群内，动脉簇V1富含SDF-1（由Cxcl12编码）和SCF（由Kit1编码）。作者随后分析了LEPR+细胞群体和COL2.3+细胞类群中造血相关因子的表达情况（图4）。

Stress response profile of the bone marrow niche

常用于治疗白血病的化疗会导致处于分裂中的造血干祖细胞耗竭，并诱导静息状态造血干细胞的增殖和分化。骨髓消融造成血窦血管和基质细胞（减少），并导致骨髓脂肪细胞的增加。为了研究急性应激条件下骨髓龛的分子动态和形态变化，作者给予单剂量的氟尿嘧啶（150 mg.kg -1）。在处理5天后，检测骨髓细胞数量，发现Lineage（Lin）-SCA-1 +CD117 +（LSK）骨髓细胞以及骨髓血管和血管周围细胞总数的显著下降(ExtendedData Fig. 6a-c)。

为了追踪应激性造血过程中骨髓龛中基因表达的变化，我们用流式细胞仪分选氟尿嘧啶处理后的骨髓，获得的7,752个细胞（Fig. 3a）。结果揭示了脂肪细胞启动的P5亚群(P5, n = 161)的形成(Fig. 3b，ExtendedData Fig. 6d)，以及在整个LEPR+和COL2.3+群体中的亚群的贡献发生变化(Fig. 3c)。

具体而言，LEPR+细胞通过脂肪细胞待扩增的亚群P2的扩增经历了大量的转录重编程。总体而言，使用5-FU治疗后，我们观察到与脂肪形成相关的通路明显上调，并且与骨谱系相关的基因表达总体下降（ExtendedData Fig. 6e，f）。在VE-Cad +和LEPR +群体上进行的两个独立的scRNA-seq实验显示，对5-FU的治疗具有相似性，血管的相关系数为r = 0.63，对于显着改变的基因，LEPR+群体的相关系数为r = 0.88，表明具有可比性实验之间的关联（ExtendedData Fig. 7）。这些结果与先前报道的骨髓损伤后脂肪细胞的扩张相一致。

对应激的另一个策略是整个骨髓龛中各亚群细胞增殖增加。在骨髓消融(清髓)后，5.4%的细胞处于细胞增殖状态，而在稳态条件下为0.7％（ExtendedData Fig. 6g，h），这可能表明清髓后再生过程的开始。

接下来，检测了5-FU介导的促造因子的变化（Fig. 3d）。我们检测到血管Ang、血管周围Il7、Bmp4和骨Wnt5a上调，血管Notch delta样配体Dll4和Dll1、黏附分子Sele和血管周围Wnt4下调。

总的来说，这些发现表明Wnt和Notch等关键通路的信号强度发生了变化。我们的研究定义了骨髓微环境对化疗反应的相当大的分子重编程。

Fig. 3: Single-cell transcriptome profiling of the bone marrow niche in response to chemotherapy

Notch ligands from vascular endothelial cells

我们的分析显示，Notch配体Dll1和Dll4在VE-Cad+细胞中特异性表达(图2f)。反转录定量PCR分析证实，与血管周细胞和骨系细胞相比，Dll1和Dll4在血管内皮细胞亚群中的高表达，而Jag1在血管和血管周细胞亚群中的表达较低，且具有可逆性(扩展数据图8a)。此外，Dll1和Dll4的表达在应激反应中动态下调(图3d)。在造血细胞中靶向notch受体信号已经建立了该通路在正常造血过程中的关键作用。然而，贯穿骨髓的特定Notch配体的身份和作用仍不清楚，JAG1是一个明显的例外，最近发现JAG1支持星状细胞自我更新。

为了进一步定位Notch配体在骨髓中的表达，我们生成了转基因报告小鼠(携带细菌人工染色体(BACs))，它们共同表达单个的Notch配体(由Dll1、Dll4或Jag1编码)和荧光标记物mCherry(图4a)。使用荧光显微镜，我们观察到Dll4和Dll1在整个胸腺皮质上皮的表达和Jag1在胸腺髓质内的表达，这与之前发表的观察结果一致(扩展数据图8b)。流式细胞术分析骨髓CD144 + (VE-Cad)血管内人口个人等级配体记者菌株证实血管内皮高Dll4的表达和中级水平的Dll1表达式(图4 b,扩展数据图8 c, d)。体内双光子成像和免疫荧光Dll4-mCherry骨头证实Dll4的表达整个骨髓血管腔室(图。4 c,扩展数据图8 e,g). Dll1还在NK1.1+造血细胞亚群中表达(图4d，扩展数据图8f-j)。综上所述，这些数据提供了一个完整的Dll4和Dll1在整个骨髓中的表达图谱。

Fig. 4: Vascular endothelial cells are the major source of Dll4 and Dll1 in the bone marrow

Regulation of HSPCs by vascular DLL4 expression

为了进一步研究血管DLL4在正常造血中的作用，我们评估了血管内皮特异性缺失DLL4的效果。我们将血管特异性、三莫西芬诱导的Cre品系(Cdh5-creERT2)与带有条件性Dll4功能缺失等位基因(标记为Dll4i3COIN)的小鼠杂交，产生了我们称之为VE-CadcreER-Dll4i3COIN的小鼠品系。Dll4后删除整个VE-Cad +血管间,我们发现林的频率减少−SCA-1lowCD117lowFLT3 + IL7Rα+常见淋巴祖细胞和扩大髓系祖人口在林−本来−CD117 + FCγR + CD34 +门(granulocyte-monocyte祖门),曾被报道含有mixed-lineage骨髓potential41岁的患者(扩展数据图9 a、b)。因此,我们观察到的损失B220 + B细胞和CD3 + T细胞淋巴细胞数量和扩大VE-CadcreER-Dll4i3COIN小鼠的骨髓Gr1一起+ CD11b +舱(图5 a - c,扩展数据图9 c, d)。尽管常见淋巴祖细胞的损失,血管Dll4的删除不影响林的频率或数字−CD117 +本来+ CD135 + IL7Rα−lymphoid-primed多能祖细胞(多能祖族群4,MPP4) 43岁这被认为是常见的淋巴祖细胞的上游的子集(扩展数据图9 h i),符合早期淋巴祖细胞的损失,我们观察到胸腺细胞结构的重大损失VE-CadcreER-Dll4i3COIN老鼠和早期胸腺祖细胞数量的减少(CD4−CD8−CD25−CD44 + CD117 +),但没有证据表明特定的胸腺细胞分化发育区块(扩展数据图9 eg)。

在没有血管Dll4的情况下，我们发现表型长期造血干细胞(Lin−CD117+SCA-1+CD150+CD48−)或多能祖细胞(MPP2亚群(Lin−CD117+SCA-1+CD150+CD48+)或MPP3-4 (Lin−CD117+SCA-1+CD150−CD48+)的频率和数量没有显著变化(扩展数据图9h，i).免疫荧光分析证实了CD150+Lin−造血干细胞和祖细胞(hpc)在Dll4-mCherry小鼠中靠近血管的位置(扩展数据图9j)。为了进一步明确血管Dll4缺失对HSPC群体的影响，我们对对照组和VE-CadcreER-Dll4i3COIN小鼠的HSPC进行了scRNA-seq。经过质量控制(见方法)，我们分析了21,116个hspc(扩展数据图9k)。为了将细胞分配到hspc的特定亚群(HSCs、MPP2、MMP3和MMP4)，我们根据之前报道的群体特异性基因签名的平均表达水平计算模块得分，为单个细胞评分(图5d)。我们的基因表达分析显示骨髓的过早upregulation program早在HSC阶段,是保存在所有后续祖因而减少HSC浓缩(扩展数据图9 l, m)。完善myeloid-associated基因ectopically中所有公司的子集(图5 e)。这些结果表明，在没有血管DLL4的情况下，造血谱系承诺的完整重组，这导致所有HSPC组分的显著髓系偏置，并为VE-CadcreER-Dll4i3COIN小鼠的表型提供了分子解释。

最后，我们通过结合Dll1-floxed等位基因(Dll1fl/fl)和VE-Cad-Cre来评估血管内皮特异性Dll1缺失对正常造血功能的作用，以生成内皮细胞特异性功能缺失小鼠(VE-Cad-Dll1fl/fl)。我们没有发现造血分化的改变(扩展数据图10)。总之，这些结果表明，血管DLL4(而不是DLL1)是一个关键的Notch配体，控制早期造血分化潜能。

Fig. 5: DLL4 expressed by vascular endothelial cells prevents myeloid skewing of haematopoietic progenitors.

讨论

越来越多的证据表明偏离了传统的造血分层模型，而是建议每个HSC能够区分不同的血统。很有可能假设这样的可塑性是由HSC和微环境的组成部分之间的独特相互作用决定的。我们的研究结果通过提供骨髓生态位的不同血管，血管周围和骨系组成部分的详细转录蓝图，扩展了对骨髓生态位的理解。

本研究，结果表明单细胞转录组分析可以转化为机制明了干细胞和祖细胞分化的调节。作者将造血因子与其细胞来源相匹配，并显示血管-内皮细胞表达的Notch配体DLL4的缺失使骨髓造血倾向于HSPC的显著的转录重编程和髓样发生。将来的研究需要研究骨髓龛异质性对功能异常干细胞的影响，如免疫缺陷，造血系统恶性肿瘤和衰老。靶向骨髓龛相关因子可能干扰疾病的发生和发展，最近已经有研究通过靶向急性淋巴细胞白血病中的血管CXCR4-CXCL12相互作用显示出来。

由于本文正文中图片出现顺序，并不是严格按照图片的顺序，特别是扩展图片更是如此。因此将扩展图片统一置于文末。

Extended Data Fig. 1 RNA-seq analysis of the bone marrow microenvironment populations

Extended Data Fig. 2 Analysis of VE-Cad+, LEPR+ and COL2.3+ populations

Extended Data Fig. 3 Characterization of VE-Cad+ subpopulations

Extended Data Fig. 4 Characterization of perivascular LEPR+ subpopulations

Extended Data Fig. 5 Characterization of COL2.3+ subpopulations and cycling cells

Extended Data Fig. 6 Effect of treatment with 5-FU on subsets of the bone marrow niche

Extended Data Fig. 7 Validation of scRNA-seq in VE-Cad+ and LEPR+ cells following treatment

Extended Data Fig. 8 Analysis of Dll4-mCherry, Dll1-mCherry and Jag1-mCherry reporter mice

Extended Data Fig. 9 Gene expression program of myeloid differentiation is enhanced in VE-Cad-Dll4i3COIN HSPCs

Extended Data Fig. 10 Deletion of endothelial Dll1 does not affect early lineage priming of haematopoietic progenitors

点评

• 亮点：首次绘制了小鼠骨髓微环境单细胞图谱，揭示了骨髓微环境的异质性；单细胞水平证实病理或者应激条件下造血等龛因子的来源细胞及其对某些疾病发生和发展的影响。
• 不足: 混样测序且细胞数量相对较少，虽然作者仅关注较大的细胞类群，但是由于骨髓微环境的复杂性，仍有可能丢失了重要的细胞亚群。不同条件的细胞整合分析批次效应明显。

文中链接

[1]

The Iannis Aifantis Lab: http://aifantislab.com/#