【生信文献200篇】95 多组学探索TNBC

Part1文献信息

英文标题： Integrative analysis of genomic alterations in triple-negative breast cancer in association with homologous recombination deficiency

期刊： 《PLOS Genetics》

发表时间： 2017年6月21日

研究领域： TNBC genomic alterations

DOI号： 10.1371/journal.pgen.1006853

Part2总述

突变基因可能成为较好的药物靶点用于抑制癌症的发生发展。研究人员通过全基因组测序、转录组及全外显子测序对TNBC基因组变异进行全面分析，并详细描述了有HR通路缺陷的肿瘤分子表型，并鉴定了受SVs影响的致癌基因TGFA。

研究人员还发现了多种可以转化3T3小鼠成纤维细胞的癌基因，这表明不同TNBC肿瘤细胞可能经历了不同的靶向基因的驱动事件。

Part3背景

TP53突变，BRCA1功能缺失，和 MYC 扩增及过表达是TNBC中常见事件。

Poly ADP-ribose polymerase (PARP) 抑制剂是针对TNBCs亚群的治疗方案。homologous recombination (HR) pathway 缺陷的肿瘤更易于受到PARP抑制剂的影响，目前已知的是BRCA1或BRCA2突变肿瘤对PARP抑制剂有应答。

Part4数据

研究人员对36对TNBC样本及正常组织样进行了WES分析，并通过RNA-seq对23个肿瘤，以及17个ER+和15个HER2+的BC样本进行分析。

原始数据：

• The raw sequencing data have been deposited in the Japanese Genotype-Phenotype Archive (JGA, http://trace.ddbj.nig.ac.jp/jga), which is hosted by DDBJ, under accession number JGAS00000000095.

公共数据：TCGA and CCLE data

• TCGA ：level 2 mutation data, level 3 mRNA expression data (RNA-seq V2 RSEM) and level 3 methylation data
• CCLE CN data were downloaded from the Memorial Sloan Kettering Cancer Center‘s cBio portal

Part5结果

1Mutational signatures define the molecular phenotype of TNBC

研究人员对36个手术切除的TNBC组织以及配对的正常组织进行了WES分析，并通过RNA-seq对23个肿瘤，以及17个ER+和15个HER2+的BC样本进行分析。与之前的研究一致，观察到TP53突变频率较高(72%)，而PIK3CA突变频率相对较低(19%)。在大多数TP53突变的肿瘤中，突变型等位基因的表达量大于野生型等位基因。

高覆盖率WGS检测到的16例TNBC肿瘤中SNVs的突变特征分析发现了BRCA特征、年龄相关特征和APOBEC特征，与之前的报道一致。研究发现，在具有BRCA signature的肿瘤中，由于BRCA1或RAD51C mRNA低表达或BRCA1突变，HR通路被认为是有缺失的。此外，所有低表达BRCA1或RAD51C的肿瘤均表现出相应启动子区域的DNA甲基化。

研究人员假设BRCA1或RAD51C的突变和启动子甲基化是由BRCA标记显性表现的HR缺陷的主要原因。为了验证BRCA1/RAD51C启动子甲基化、BRCA1/RAD51C mRNA表达和突变特征之间的关系，研究人员分析了TCGA数据(110个TNBC样本)。发现BRCA1/RAD51C低表达与BRCA1/RAD51C启动子区域高甲基化水平密切相关。

高覆盖率WGS分析识别出大量的体细胞SVs，被分为四种类型:易位、倒置重排、缺失和串联复制，HR途径有缺陷的肿瘤的SV计数高于HR途径完整的肿瘤。因此，BRCA1或RAD51C功能的缺失与显性BRCA特征和更高的SV数相关。BRCA1缺陷与串联重复数量的增加显著相关(图1c)。

2Analysis of clonal architectures in TNBC

研究人员为了保证数量的准确性，使用CN为1的区域的数据来分析克隆结构。为了进行基于CN的全局分析，研究人员首先确定了次要等位基因对数R比值与肿瘤细胞数量之间的相关性。基于这种相关性，克隆结构是通过使用来自小等位基因CN为零的区域的数据推断出来的(图2A)。基于CN的整体分析显示，每个肿瘤中只有少数可检测到大小的亚克隆(图2B)，这与之前的单细胞分析结果一致。

接下来，研究人员使用SNV的变体等位基因频率（VAFs）确定TNBC样本的局部克隆结构。单独分析具有低CNS的所选区域内的VAF（图2C）。在TN-19的情况下，使用PyClone进行分析，发现一个具有89%的细胞数量(或100%的克隆性)的间断克隆，及具有42%的细胞数量(或47%的克隆性)的亚克隆。值得注意的是，在所有CN-low区域的VAFs分析和基于CN的全局分析中也发现了这个亚克隆(图2A)。TN-19的截断克隆含有编码TP53 (R213L)和APC (E109X)的突变，主亚克隆发生了4号染色体长臂部分双等位基因缺失，包括CASP3位点。对其他肿瘤的分析显示，BRCA1 / RAD51C启动子区域中具有TP53突变或甲基化CPG二核苷酸的细胞的细胞性与Truncal克隆的突变区一致，表明大多数TP53突变和BRCA1 / RAD51C的促进剂甲基化被在Truncal克隆中获得（图2D）。

综上：肿瘤的CN状态在肿瘤进化过程中是稳定的，TP53突变和BRCA1/RAD51C的沉默是TNBC癌发生的早期事件。

3Characteristics of SVs in TNBC

有研究表明，染色体内的SVs比染色体间的SVs更普遍。染色体内sv的断点显示交叉发生的方式很复杂，表明TNBC中sv的机制很复杂。染色体内sv断点之间的距离出现了意想不到的三峰分布，峰值约为5 kbp、300 kbp和10 Mbp(图3A)。HR途径有缺陷的肿瘤具有断点间距离较短的SVs。

一些穿过着丝粒的倒置重排可能导致TN-19的8号染色体、TN-9的19号染色体和TN-2的3号染色体的CN改变(图3B)。研究人员提出了一种新的CN改变模式，即染色体臂的一部分被同源染色体对臂的一部分以反向重排的方式取代，从而导致染色体区域CN增益和丢失。基于这一假设，观测到的CN状态可以用观测到的倒序重排来简单解释(图3B)。

总之，WGS揭示了SVs的大小根据SV的类型具有独特的分布。它还揭示了涉及倒重排列的过程，通过染色体区域获得或丢失染色体区域。

4SVs affect oncogenes and tumor suppressor genes in TNBC

研究人员对36例TNBC肿瘤的WES分析仅发现了2个RB1突变、2个KMT2C突变、2个PTEN突变和1个RUNX1突变。然而，WGS分析显示，这些抑癌基因在TNBC中经常被SVs破坏。在16个被分析的TNBC肿瘤中，6个、3个、2个和1个肿瘤分别含有涉及RB1、KMT2C、PTEN或RUNX1的SVs。SVs也导致了癌基因MYC、NOTCH2和NOTCH3的扩增，并导致相应基因的表达增强。在48个FFPE标本中，还发现了两个NOTCH2位点扩增的肿瘤。

综上所述，这些结果表明，基因重排在TNBC中的主要后果似乎是肿瘤抑制编码序列的破坏和癌基因的扩增和表达增强。

5Recurrent SVs in the putative regulatory region of the TGFA gene

研究人员进一步检测了受SVs影响的基因。在TNBC的亚型中发现TGFA基因被激活表达（图4A），并在五个肿瘤中观察到TGFA位点内或附近的SVs（图4B）。TCGA BC队列的CN数据分析显示，TGFA位点内或附近有17个可能的sv(图4D)，它们在TNBC中富集。TGFA mRNA在这些肿瘤中的表达显著增高(图4C和4D)。这些数据表明所观察到的sv与TGFA表达增强有关。

根据CCLEdata的数据，TGFA在下咽鳞状细胞癌细胞株BICR6中表达升高，该细胞株具有涉及TFGA位点的局部CN增益，类似于TNBC肿瘤样本。

在BICR6细胞中，组蛋白H3 (H3K27ac) 27位赖氨酸残基的乙酰化富集在重复TGFA位点上(图4E)。尽管BICR6细胞系并非起源于乳腺组织，但根据ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements)项目数据，BICR6细胞中TGFA位点的H3K27ac剖面与人类乳腺上皮细胞相似。H3K27ac的结合谱确定了7种可能的增强子(图4F)，其中e6对H3K27ac富集最显著。这些观察结果表明，h3k27ac富集区域可能是TGFA表达的调控区域，BICR6可用于研究TGFA位点内或附近的SVs的功能作用。

为了确定富含h3k27ac的基因组区域是否需要在BICR6细胞中增强TGFA的表达，使用CRISPR-Cas9系统删除了包含e6的区域。BICR6细胞中该区域的缺失导致TGFA的表达下降(图4F)，表明该区域具有直接的调节功能。在使用BICR6细胞的荧光素酶报告基因检测中，发现e6区域具有很强的活性(图4G)。相反，TGFA的异位表达赋予MCF10A乳腺上皮细胞生长因子的独立性(图4H)。综上所述，这些结果表明，涉及TNBC中TGFA调控区域的SVs可能导致TNBC中另一个候选癌基因TGFA表达增强。

6Various oncogenic driver mutations in TNBC

接下来，研究人员通过软琼脂试验寻找产生潜在致癌基因的SNVs。在编码NFKB1 (N580S)的NFKB1基因中发现了一个突变(图5A)。根据TCGA的泛癌数据，NFKB1的突变沿着蛋白分布，在锚蛋白重复结构域内适度富集(图5A)。虽然在BC中检测到NFKB1锚蛋白重复域(T585M)的另一个突变，但其意义尚未分析。值得注意的是，NFKB1 (N580S)和(T585M)都能给予小鼠3T3成纤维细胞非锚定生长(图5E)，这强烈表明突变蛋白具有致癌潜力。在36个冷冻肿瘤样本中，有2个样本在NOTCH1的PEST域内存在框移突变(图5B)。表明NOTCH通路在TNBC的亚群中被基因变异激活。

研究人员还发现了一个表达FGFR3-CAT融合转录本的肿瘤(图5D)。表达FGFR3-CAT融合蛋白的3T3细胞在小鼠体内形成肿瘤(图5E, S9图)。因此，SVs在TNBC中导致了致癌基因的融合。然而，研究人员试图在TCGA RNA-seq数据中鉴定涉及FGFR基因(FGFR1、FGFR2和FGFR3)的融合基因，但没有成功。

上述多种致癌驱动事件的鉴定表明，单个的TNBC肿瘤可能具有独特的致癌驱动事件，即TNBC肿瘤发生因素不单一。