肿瘤多区域取样的进化分析五：追踪非小细胞肺癌的进展

Tracking the Evolution of Non–Small-Cell Lung Cancer

IF:70.67

导语

GUIDE ╲

全世界范围内，肺癌是癌症相关死亡的主要原因，小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型。大规模的测序研究揭示了NSCLC复杂的基因组结构，以及肺腺癌和肺鳞癌之间的基因组差异。然而，对NSCLC瘤内异质性(为肿瘤演变和耐药提供了“燃料”)和肿瘤基因组演变的深入研究仅限于小范围的回顾性研究。因此，本研究探讨了肿瘤内异质性的临床意义。

背景介绍

追踪非小细胞肺癌的治疗进展(TRACERx)是一项多中心前瞻性队列研究，从2014年4月开始招募，资金来自于英国癌症研究。目标登记人数为842名患者的样本将被用于高深度、多区域的全外显子组测序，这些患者均为IA至IIIA期手术切除的NSCLC肿瘤。

TRACERx的主要目标是研究肿瘤内异质性，研究从突变的角度(单核或双核苷酸碱基替换或小的插入和缺失)或体细胞拷贝数改变(反映染色体片段的得失)与临床预后相关性。本工作汇报了在研究中招募的前100名患者。

数据介绍

100例未接受过系统治疗的NSCLC患者的肿瘤样本（图1A）。患者年龄至少为18岁，且在IA至IIIA期被诊断为非小细胞肺癌（患者CRUK0035除外，根据术后组织学分析，肿瘤为IIIB期）。

为了评估肿瘤内部的异质性，至少有两个肿瘤区域的取样样本，它们之间的距离为0.3 cm到1 cm(取决于肿瘤的大小)。所有的肿瘤都没有发生ALK、ROS1或RET移位。

使用Illumina HiSeq对从每个肿瘤采集的多个区域样本进行全外显子组测序，对327个肿瘤区域样本（323个原发肿瘤区域和4个淋巴结转移）和100个匹配的血液样本进行测序。所有的测序数据都已存入European Genome–Phenome Archive数据库，登录号为EGAS00001002247。

结果解析

01

非小细胞肺癌的瘤内异质性

肿瘤内的遗传多样性可以作为自然选择和肿瘤进化的基础。本工作通过进行多区域的全外显子测序将体细胞突变（编码和非编码单核苷酸变异）和拷贝数变异进行分类，分类成克隆（存在于所有肿瘤细胞）和亚克隆（存在于肿瘤细胞的一个子集）（图1）。

结果观察到样本中具有广泛的瘤内异质性，30%的体细胞突变被识别为亚克隆，48%的拷贝数改变被识别为亚克隆（图2A）。说明在肿瘤发生过程中，突变和染色体水平的基因组不稳定过程正在进行。肿瘤间的异质性也存在相当大的差异，亚克隆突变的数量从2到2310不等，受亚克隆拷贝数改变影响的基因组比例从0.06到81%不等（图2A）。与单样本分析或使用TCGA的NSCLC单样本相比，多区域全外显子组测序发现的突变明显更多。

鳞状细胞癌的克隆突变明显多于腺癌。这一发现可能反映了是由吸烟史的差异。鳞状细胞癌与腺癌在亚克隆突变的数量或比例上没有显著差异。在特定的腺癌组织病理学亚型中也没有显著差异。在腺癌中，肿瘤分期与亚克隆拷贝数改变的比例呈正相关，Ki67染色与克隆和亚克隆突变的负荷呈正相关，与亚克隆拷贝数改变的比例呈正相关。此外在腺癌中，吸烟者的克隆和亚克隆突变负担明显高于从未吸烟的患者。

亚克隆突变的比例((队列中值为30%)与无复发生存率之间没有显著的相关性（图2B）。然而，初步分析中发现，亚克隆拷贝数改变比例高的患者比亚克隆拷贝数改变比例低的患者复发或死亡的风险更高（图2C）。在对年龄，吸烟史，组织学亚型，辅助治疗和肿瘤分期进行调整后，该发现在多变量分析中仍然具有重要意义。染色体破坏的静态测量（描述肿瘤区域中异常基因组的平均比例）与存活率无关，这表明进行中的动态染色体不稳定率而非基因组状态是预后相关的。

02

肺小细胞肺癌的进化史和肿瘤克隆体系结构

亚克隆突变的数量或比例不能完全反映瘤内异质性的程度，因为这些指标不能反映在空间和时间上进化的遗传上不同的亚克隆的数量或普遍性。为了阐明区域内的亚克隆并绘制每个肿瘤的进化史，下面根据它们的细胞普遍性对突变进行了聚类，每个簇代表肿瘤系统发育树上的一个节点和一个存在于肿瘤群体或在其进化史上存在的亚克隆。最后确定了525个突变簇，每个肿瘤的中位数为5。研究发现，大多数肿瘤区域(86%)只携带来自系统发育树单个分支的亚克隆，这强调了单个诊断活检样本在准确捕获肿瘤内部异质性的真实程度方面的局限性。如果不使用多区域的全外显子组测序，65%的分枝亚克隆簇可能被错误地认为是克隆的。

03

肺小细胞肺癌瘤内异质性的起因

（1）突变过程

了解突变过程是如何形成肿瘤的进化的，有助于在临床环境中限制肿瘤适应的策略。Spearman’s rank correlations方法发现，早期突变（在基因组加倍或拷贝数改变之前累积）的数量与吸烟相关的突变负荷（突变特征4）显著相关。这一发现与烟草致癌物引起的突变的鉴定是一致的，这是对树干长度的关键影响。在长期吸烟者的7/12例腺癌患者在晚期克隆突变中可检测到吸烟信号，该发现说明在具有临床表现之前，肺腺癌演变过程中的肿瘤潜伏期较长。

在鳞状细胞癌中，累计吸烟量与吸烟相关特征4之间无显著相关性，基因组加倍（早期突变数与晚期突变数之比）的时间明显晚于腺癌。

亚克隆突变负荷与亚克隆突变数之间存在显著的相关性。亚克隆突变负荷最大的肿瘤有广泛的APOBEC介导的诱变，以及APOBEC突变的空间异质性。15例患者的肿瘤的亚克隆驱动突变可能与APOBEC活性有关，这说明APOBEC诱变可能频繁地诱发亚克隆驱动事件，从而促进亚克隆扩展。

（2）染色体不稳定性和基因组倍增

考虑到以拷贝数改变和较短无复发生存为特征的肿瘤内异质性之间的关系，接下来进一步探讨了不同肿瘤区域的染色体改变动力学，以及染色体的不稳定性可能在多大程度上驱动肿瘤内异质性。通过多区域全外显子组测序，利用肿瘤的生殖系杂合单核苷酸多态性，可以确定在肿瘤系统发育树的不同分枝上的不同亚克隆中是否获得或丢失相同或不同的亲本等位基因。具体来说，如果母方等位基因在一个区域的一个亚克隆中得到或失去，而父方等位基因在另一个区域的另一个亚克隆中得到或失去，则会导致镜像亚克隆等位基因不平衡的图谱（图3A-B）。这种不平衡现象表明存在额外的染色体不稳定性，也可能反映出平行进化，涉及多个不同事件，这些事件汇聚在不同亚克隆的同一基因上。 在具有多区域全基因组测序的拷贝数数据的92个肿瘤中，有62％观察到了这种现象。

染色体不稳定性也可能通过携带克隆突变的基因片段丢失而直接导致突变异质性。总体而言，由于与拷贝数变化有关的丢失事件，每个样品中位数为13％的亚克隆突变可能是亚克隆的，这表明染色体的不稳定性可能是拷贝数和突变异质性的发起者。

越来越多的证据表明，基因组加倍事件与癌细胞生物染色体不稳定性有关，并可能预示预后不良。本工作在76%的肿瘤中发现基因组加倍事件，除了3个肿瘤，其余肿瘤均为克隆，表明全基因组复制是NSCLC进化的早期事件。在腺癌中观察到，基因组加倍与两种亚克隆突变频率和亚克隆拷贝数变异之间存在显著的相关性。此外，镜像亚克隆等位基因不平衡在双基因组肿瘤中显著富集。

04

选择与平行进化

破译肿瘤中正在进行的选择的证据可能有助于阐明进化的限制，从而确定治疗的目标。约束和选择的例子是平行进化的出现，即单个肿瘤内不同分支的体细胞事件聚合在同一基因、蛋白复合物或通路上。本工作在突变水平上没有发现平行进化的证据。然而，不同亚克隆中不同亲本等位基因的局灶性扩增发生在5个肿瘤中，并影响到已知的癌症基因，包括MUC1、CDK4、CHD8和NKX2-1（图3C）。在染色体臂水平，13个肿瘤中观察到潜在的平行进化。大多数染色体臂获得(10/11)和损失(6/8)的平行进化在以前已被归类为NSCLC中显著获得或显著损失。

为了先验评估在突变层面的阳性选择，接下来使用替代比例（dN / dS，非同义位点比同义位点）解释了每个突变的三核苷酸背景，并决定了与背景突变率相比，是否存在蛋白质改变突变的富集。当考虑所有外显子错义突变时，观察到18个阳性选择(dN/dS， >1)。这一发现表明，非小细胞肺癌的突变可能是由选择形成的。然而当对突变进行时间上的解剖时，发现明显的阳性选择发生在突变的晚期，而不是早期。与这一发现一致，无义突变被发现在肿瘤发展的早期而不是晚期(dN/dS， <1)。以上说明，在NSCLC的进化过程中，选择是持久的，约束决定了进化轨迹。

05

克隆和亚克隆驱动改变和基因组事件的时间

确定癌症驱动事件是早发生还是晚发生可以表明其是否参与了肿瘤的发生或维持，其克隆性可以为潜在的治疗策略提供参考，因为亚克隆改变仅存在于一定比例的细胞中，当靶向时可能导致肿瘤的减少。本工作确定了795个driver事件，77个肿瘤中的219个driver为亚克隆，576个是克隆。多区域全外显子组测序比单例分析更能识别驱动因素的改变。

某些癌症基因的改变不仅主要是克隆性的，而且几乎总是发生在基因组复制之前，这表明它们参与了肿瘤的发生（图4）。在腺癌中，这些改变包括EGFR、MET和BRAF的靶向性突变或扩增等。在鳞状细胞癌中，NOTCH1突变等是早期克隆事件。这两种亚型的TP53突变主要是克隆性和早期性的。相反其他驱动事件，虽然主要是克隆性的，但也常常发生在基因组复制之后，这表明它们参与了肿瘤的维持或进展。72个drivers的51% 影响染色质重构、组蛋白甲基化或DNA损伤反应和修复，在所有组织学亚型中是亚克隆或晚期的。

早期发生的驱动突变发生在已建立的组织学亚型特异性癌症基因中的趋势明显大于晚期或亚克隆驱动突变，这影响了更广泛的泛癌基因选择。这些数据与dN/dS突变选择分析一致，并表明随着肿瘤的发展，癌症进化中固有的约束条件也会发生变化，这可能会使更多的进化路径更容易发生进展。

总的来说，研究的100个肿瘤中有86个发生了正在被研究的改变，涉及非小细胞肺癌的基因组药物研究，包括National Lung Matrix Trial (NLMT)和Molecular Analysis for Therapy Choice(MATCH)试验。在这86个肿瘤中，有17个(20%)发生了亚克隆靶向突变和拷贝数改变。这17个肿瘤中的12(71%)个，同时存在一个克隆和一个亚克隆的靶标改变，这表明靶标可能优先用于治疗干预。

小编总结

本工作对100例肺癌患者进行多区域的肿瘤进行全外显子测序分析，首先发现肿瘤不同区域有瘤内异质性，然后通过构建系统发育树研究非小细胞肺癌的进化史，接下来对NSCLC瘤内异质性的起因进行分析，主要围绕突变过程是如何形成肿瘤的进化的和染色体的不稳定性可能在多大程度上驱动肿瘤内异质性进行研究分析，然后又对肿瘤的平行进化和克隆和亚克隆驱动改变进行分析。

引用：

Jamal-Hanjani M, Wilson GA, McGranahan N, et al. Tracking the Evolution of Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 2017;376(22):2109–2121. doi:10.1056/NEJMoa1616288

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