肿瘤多区域取样的进化分析二：食管鳞癌及其前体细胞病变的基因组比较

Genomic comparison of esophageal squamous cell carcinoma and its precursor lesions by multi-region whole-exome sequencing

Nat Commun. 2017 Sep 12; doi: 10.1038/s41467-017-00650-0

导语

GUIDE ╲

食管癌是第8大常见癌症，第6大致命癌症，5年生存率低至15%~25%。食管鳞状细胞癌（ESCC）是食管癌的主要亚型，占全世界食管癌病例的90%，其发病机制、危险因素和基因组结构都与EAC不同。今天我们继续分享关于ECSS的多区域取样分析。

背景介绍

ESCC的发病机制是一个多步骤的过程。鳞状上皮细胞核出现异型，细胞异常成熟。这个阶段为异型增生，是ESCC的前体病变。目前仍然不清楚从鳞状异型增生到ESCC的演变过程，特别是关键的致癌事件是如何发生以及在哪个阶段发生的。

对同一患者的前体病变和肿瘤区域进行采样，是研究肿瘤演变过程的一种实用方法。研究食管腺癌（EAC）肿瘤演变也应用了类似方法。

数据介绍

样本取自中山大学肿瘤中心肿瘤资源库。45例ESCC患者（TD），13例异型增生患者（NTD），所有患者术前均未接受任何治疗。从TD中的25例获得了配对的异型增生和肿瘤样本。共157个样本，包括62个肿瘤（59个ESCCs和3个淋巴结转移）样本，44个低分级异型增生（LD）样本，31个高分级异型增生（HD）样本，7个正常上皮样本，13个NTD样本 。所有样本的平均测序深度为83X。

结果解析

01

鳞状异型增生与ESCC突变负担相似

对于所有ESCCs，总突变数53~507，非沉默突变中值为80（2.9突变/Mb），沉默突变34（1.1突变/Mb），与之前的研究结果相似（Fig. 1b：所有NTDs、LDs、HDs 和ESCCs与其他几种癌症的突变密度比较）。

在突变背景下鳞状异型增生和ESCC样本中，C>T转换是显著富集的，特别是在CpG二核苷酸上（Fig. 1c，d），说明胞嘧啶的自发脱氨作用是肿瘤发生过程中突变积累的主要原因。

02

鳞状异型增生与ESCC的突变谱

为了观察整体突变情况，比较所有样本中ESCC相关驱动基因的突变频率。一般情况下，大部分驱动基因也出现在高突变频率的异型增生样本中（Fig.2）。TP53突变在异型增生样本中频率很高（95.6%），甚至在NTDs中也发现了一些突变 （30.8%；Fig. 2），提示TP53突变可能在ESCC进展的早期发生。

03

鳞状异型增生与ESCC存在明显的异质性

TD中多（≥3）个样本的患者的异型增生样本和ESCCs突变的区域分布 （Fig. 3a，c，e）。构建系统发育树来描述克隆关系和排序事件（Fig. 3b，d，f）。

Fig. 3：典型病例的体细胞突变和系统发育树的区域分布。a-f：热图显示每个病例中所有突变在不同样本之间的区域分布。突变类别与系统进化树线条的颜色对应。树干和树枝的长度与突变数量成正比。热图中存在一些与系统发育树不匹配的突变。g-i：箱形图展示在每种情况下成对样本的异质性指数（HI）、欧几里德距离和交叉突变的密度（以负值表示）。

04

拷贝数改变发生于ESCC早期

低深度全基因组测序评估33异型增生样本和33 ESCCs的拷贝数状态，显示广泛的CNAs（Fig. 4a），拷贝数模式高度相似。NTD的异型增生样本中有8例存在大量CNAs（Fig. 4c），CNAs发生在ESCC发展的相对早期阶段。此外，3q和5p上的CNA增加以及3p上的CNA缺失在其他癌症中普遍存在，突出了它们在鳞状细胞癌发生发展中的重要作用。3q的扩增可能出现在恶性转化的初期。

无论在异型增生样本还是在ESCCs中，SOX2、PIK3CA、MYC、CCND1和FGFR1基因上扩增的发生率都很高（Fig. 5a）。基因组倍增在TD中普遍存在，但在NTD中不存在（Fig. 5b）。

来自同一患者的所有样本中，CNAs的异质性程度与突变的异质性程度基本一致。然而，在TD中几个病例的突变分布不同，但拷贝数模式高度一致，表明在这些患者中，CNAs不仅出现较早，而且在ESCC进展过程中也保持稳定。

05

TP53突变协同LOH对肿瘤恶变影响

对于每一个ESCC相关的驱动突变，评估TD组的病人中每个驱动基因作为一个树干突变的比例，发现只有TP53对主干有显著的偏向 （Fig. 6a；Fisher’s exact test，P<0.001）。有36病例的所有样本都至少有一个TP53突变。此外，13个NTDs中有4个TP53基因突变（Fig. 2）。推断TP53突变出现在ESCC早期，大多数突变发生在p53蛋白的DNA结合区域（Fig. 6b）。

TD和NTD中异型增生样本之间，TP53杂合性的损失（LOH）存在显著差异（Fig. 6c）。在TD的71个异型增生样本中有69个存在TP53突变协同LOH 。

小编总结

在本研究中，通过将WES应用于同一患者的不同阶段（从异型增生到ESCC）的多个样本，最先展示ESCC前体病变的基因组改变，并描述了ESCC发展中的克隆进化。发现异型增生与肿瘤之间存在明显的异质性，TP53的突变和3q的拷贝数增加是ESCC发展的早期改变。

用到的算法和方法

1. BWA（默认参数）比对测序序列与参考基因组hg19（UCSC），生成BAM

2. Samtools对BAM文件进行排序和合并

3. Picard工具标记和删除副本

4. 基因组分析工具包(GATK2.1-8)对所有插入和缺失重新比对并质量校正

5. GATK Unified Genotyper召回SNVs和INDELs

6. 联合调用方法MultiSNV召回SNV，需手动检查以确保真实准确

7. SNPEFF 3.0对所有变异进行注释

8.MEGA 最大简约算法推断每个患者样本间的亲缘关系

9.两个R包

（1）DNAcopy采用CBS算法分割拷贝数数据，识别拷贝数异常的基因组区域

（2）Sequenza肿瘤细胞纯度计算

参考：

Chen X X , Zhong Q , Liu Y , et al. Genomic comparison of esophageal squamous cell carcinoma and its precursor lesions by multi-region whole-exome sequencing[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):524.

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