肿瘤多区域取样的进化分析三：突变分析揭示复发性胶质瘤的起源和治疗driver进化

Mutational Analysis Reveals the Origin and Therapy-Driven Evolution of Recurrent Glioma

2014 Jan 10

SCIENCE

IF:41.037

导语

GUIDE ╲

肿瘤的遗传景观是在不断地进化，这会妨碍对癌症复发性疾病患者的临床管理。与血液恶性肿瘤的克隆演化和实体瘤转移相比，实体肿瘤手术后在一些进化压力下会发生局部再生长，会进一步影响的辅助疗法。

背景介绍

通过获得新的突变，残余的肿瘤细胞可以发展到更具侵袭性的状态。II级星形性胶质瘤即遭受这种现状，虽然手术是治疗的标准，但这些侵袭性脑肿瘤通常会复发。许多复发时仍为II级，而另一些会进展到较高的组织学分级，预后较差。恶性进展的发生率和发生时间是可变和不可预测的。

本工作对初始和复发的胶质瘤进行了基因组序列分析，以解决两个问题:（1）初始肿瘤的突变与随后复发的肿瘤的差异有多大?（2）化疗与一种常用于治疗胶质瘤的药物替莫唑胺(TMZ)，会如何影响肿瘤复发的突变?

数据介绍

对23例在最初诊断时的胶质瘤进行外显子测序，11年后切除复发肿瘤再次进行外显子测序。选择了以星形细胞为主要组织学特征的初始肿瘤，选择了以星形细胞为主要组织学特征的初始肿瘤，这些肿瘤样本包含了胶质瘤进展的全谱(复发时的组织学II级到IV级)和辅助治疗史。肿瘤和匹配的正常DNA序列的平均覆盖率为125倍，使对突变检测的敏感性降低到只有10%的变异频率，包括小的插入和删除，以及DNA拷贝数的变异（CNVs）（Fig. 1A）。

结果解析

本工作在每个初始肿瘤中平均识别出33个体细胞编码突变，其中54%在复发时也被检测到(共享突变)(Fig. 1A)，其他的体细胞突变只在最初的肿瘤中发现，或只在来自特定患者的复发肿瘤中发现(私有突变)。初始和复发的胶质瘤表现出广泛的遗传相关性。有4例肿瘤呈线性克隆进化模式，推断这些患者的复发肿瘤是由≥75%的初始肿瘤中检测到突变的细胞引起的(Fig. 1B)。有3名患者的肿瘤显示出分枝性克隆进化，推断这些患者的复发性肿瘤是由最初肿瘤早期阶段细胞进化的，因为复发性肿瘤共享≤25%的最初肿瘤中检测到的突变。17号患者是分支性克隆进化的一个极端例子，因为最初的和复发的肿瘤只共享一个突变IDH1 R132H (Arg132→His)(Fig. 1C)，暗示了IDH1突变是low-grade 胶质瘤发生的起始事件。IDH1突变是每个患者唯一共有的突变，支持了目前对IDH1作为治疗靶点的相关研究。余下的16例患者的肿瘤呈现出线性和分枝性克隆进化的连续体。这些数据说明了基因相似的low-grade胶质瘤在手术切除后分化的程度，在肿瘤早期的发展过程中可能出现复发。

许多实体瘤，包括胶质母细胞瘤(GBM)，显示瘤内异质性。接下来分析了病例肿瘤内异质性的程度，首先分析了BRAF V600E(Val600→Glu)突变，该突变在18号患者的初始肿瘤中为亚克隆，通过外显子组测序或PCR在复发肿瘤中均未检测到(Fig. 1D)。BRAF V600E在3/6个最初肿瘤不同位置区域中，二复发的7个不同位置样本均缺乏这种突变。这些结果表明尽管BRAF 突变通常具有增殖优势，但该突变的克隆没有扩增。

接下来对三个病例样本的其他位置上不同的样本进行外显子组测序，以进一步确定由于瘤内异质性，明显的私有突变可能被错误分类的程度。17号患者中，除了IDH1外，所有突变都是私有的，在最初和复发的肿瘤中观察到瘤内异质性。然而从突变谱中推断，3个初始肿瘤样本和4个复发样本都由一个只有IDH1 R132H突变的普通肿瘤细胞衍生(Fig. 2A)。此外，与初始肿瘤中观察到的不同，复发的肿瘤中含有突变的驱动因子TP53和ATRX。通过对这些基因丢失的强烈持续选择，暗示了肿瘤趋同表型进化。最初和复发的肿瘤可能不是独立发生的，因为它们也共享三个体细胞非编码突变。因此，尽管局部和相对快速的复发，最初的和复发的肿瘤只是远亲关系，除了IDH1 R132H外，其他外显子突变仅在该患者发病过程中短暂存在。最后，对来26号和27号患者的初始和复发肿瘤的不同样本进行外显子组测序。发现实际上只有一小部分的私有突变是共享的(7%)，因此，肿瘤内的异质性并不能解释这一组中初始肿瘤和复发肿瘤之间的大部分遗传差异，包括在复发中未检测到的初始肿瘤的驱动突变。

为了研究单个患者的连续复发是否可以追溯到最初肿瘤的同一进化阶段，对4号患者的第二个和第三个复发肿瘤进行测序，构建了一个疾病发展史的克隆排序(Fig. 2B)。最初的肿瘤和三个连续的局部复发是克隆相关的。所以推测引发第二次复发的肿瘤细胞比引发第一次复发的肿瘤细胞在稍早一点的进化阶段就从最初的肿瘤分支出去了。相反，第三次复发的肿瘤是第二次复发的直接产物。这些结果表明，克隆进化的分支和线性模式发生在同一患者的不同时间，因此不是肿瘤的固有属性。

除了最大限度的安全的手术切除外，目前对低级别胶质瘤患者没有标准的治疗，可选治疗有监测，单独辅助辐射，单用TMZ，或辐射加TMZ。然而目前还没有关于TMZ治疗II级星形细胞瘤是否能延长总生存期的信息，所以接下来通过比较初始低级别胶质瘤和治疗后复发的胶质瘤，来确定TMZ辅助化疗如何影响复发肿瘤的突变特征。6/10的具有高突变的患者使用TMZ有复发，其中97%是C>T/G>A，主要发生在CpC和CpT二核苷酸，这是TMZ诱导突变形成的一个特征，不同于非高突变肿瘤。同时如果在匹配的初始肿瘤中未检测到C>T/G>A转移，则将每个高突变肿瘤中的C>T/G>A转移归类为TMZ相关，并在TMZ治疗前切除(Fig. 3A)。为了确定初始肿瘤的瘤内异质性是否导致某些突变被误分类为TMZ相关，对来自患者的三个不同位置的初始肿瘤样本进行测序， 对于TMZ相关的突变读数很少，而且偶然发现的比率不高于预期，进一步说明是TMZ所致。

TMZ的耐药性的产生有一部分是由于抑制DNA错配修复(MMR)通路的获得性突变，MMR通路失调和持续TMZ暴露可导致高突变。实际上发现，高突变的肿瘤获得了MMR基因的体细胞突变，而这些突变在最初的肿瘤中没有被检测到，同时还发现了MGMT的异常DNA甲基化。

数以千计的新生突变的引入可能会促使TMZ耐药胶质瘤细胞向更高状态的恶性潜能进化。事实上，六个复发肿瘤都显示出TMZ诱导的超突变进展为GBM（预后差的高级肿瘤）。为了确定TMZ相关突变可能从低级别胶质瘤中促进向GBM生长，重点研究了RB和Akt-mTOR信号通路，因其与高级别胶质瘤相关(Fig. 3B)。在每一次高突变复发中，TMZ相关突变都会影响这两条通路中重要信号分子的编码基因，如RB通路中识别的一个TMZ相关的RB1 c.2520+1G>是遗传性视网膜母细胞瘤患者生殖系中发现的一个剪接位点突变，转录组测序证实，该突变引发异常剪接、过早终止和生长抑制所必需的RB1 C-末端区域的丢失(Fig. 3C)。基因集富集分析进一步证实了肿瘤复发后RB1介导的细胞周期调控的解除(Fig. 3D)，说明TMZ诱导的突变破坏了RB抑癌通路的功能。

接下来研究了可能激活Akt-mTOR信号通路的TMZ关联突变。在18号患者的复发肿瘤中发现了一个TMZ相关突变(PIK3CA Glu542→Lys)，该突变可激活Akt并诱导mTOR依赖的致癌转化。同样，经TMZ处理的24号复发患者中也存在TMZ相关突变，PTEN(Ala121→Thr和Gly165→)。最后，在体外验证了TMZ相关的MTOR S2215F (Ser2215→Phe)突变，在1号患者的复发肿瘤中是结构性突变激活的，此外该复发肿瘤的邻近区域显示异质mTORC1活性(Fig. 3E)。显微解剖显示，尽管这些相邻区域共享了在初始肿瘤中发现的突变的一个子集，MTOR S2215F等TMZ相关突变仅存在于mTORC1活化较强的区域，该区域增殖标记物Ki-67染色较高，提示TMZ相关突变具有增殖作用。远端第二复发包含了相同的TMZ相关突变，且mTORC1靶细胞染色强烈且均匀。虽然第一次复发的两个区域均为GBM，但高突变的亚克隆在体内进行了选择，向远端侵袭，并播下了第二次复发的种子。

根据对6例高突变复发性肿瘤患者中4例的另外不同位置的初始肿瘤样本的分析，没有证据表明RB和Akt-mTOR信号通路的突变先于TMZ治疗。非高突变的复发性肿瘤进展为GBM也在这些信号通路中发生了遗传变化，但是通过其他机制。相比之下，II-III级的复发在这些通路中没有获得突变。表明TMZ治疗和致癌的驱动突变之间存在联系。

通过直接比较胶质瘤的初始诊断和复发时的基因组结构，可以推断出引起复发的肿瘤细胞浸润和辅助TMZ治疗的突变特征。复发通常不是来自于在初始肿瘤中发现的具有全套突变的细胞，这与在辅助化疗缺乏选择性压力的情况下局部复发是一致的。也证实了低级别胶质瘤的另一种进化途径，是主要由TMZ辅助化疗决定的。这扩展了早期对原发性GBMs、非配对复发性肿瘤和细胞培养模型的研究。未来的基础和临床研究必须权衡TMZ的初始抗肿瘤作用与诱导新的驱动突变和恶性进展的潜在风险。最终，更好地了解导致肿瘤复发的侵袭细胞以及辅助治疗对其演变的影响，将有助于开发新的策略来延迟或预防复发和恶性进展。

小编总结

本工作对对23例胶质瘤初始样本和复发肿瘤进行测序分析，通过对比复发前后的体细胞突变，分析其复发肿瘤的来源和瘤内异质性。然后进一步的分析由于瘤内异质性，私有突变可能被错误分类的程度。接下来对患者的反复复发肿瘤分析，发现克隆进化的分支和线性模式发生在同一患者的不同时间。然后通过比较初始低级别胶质瘤和治疗后复发的胶质瘤，来确定TMZ辅助化疗如何影响复发肿瘤的突变特征，发现TMZ的使用会引入新生突变，并且可能会促使TMZ耐药胶质瘤细胞向更高状态的恶性潜能进化，机制是TMZ诱导的突变破坏了RB抑癌通路的功能。

引用：

Johnson BE, Mazor T, Hong C, et al. Mutational analysis reveals the origin and therapy-driven evolution of recurrent glioma. Science. 2014;343(6167):189–193. doi:10.1126/science.1239947

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