肿瘤多区域取样的进化分析六：复发的神经母细胞瘤表现频繁的RAS-MAPK通路突变

杂志：nature genetics

IF:25.455

导语

GUIDE ╲

神经母细胞瘤是一种外周交感神经系统的小儿肿瘤。肿瘤的表现从自发退化到无法治愈的进展不等。尽管有广泛的治疗，如化疗、手术、放射治疗和免疫治疗，高风险神经母细胞瘤患者的存活率仍低于50%。在大多数患者中，可以观察到对治疗的初步反应，然而，这些患者中高达60%的患者随后复发，并伴有难治性肿瘤。一些遗传变异，包括MYCN扩增和染色体节段性改变，如1p缺失、11q缺失或17q扩增，与预后不良有关。然而，尚不清楚哪些遗传缺陷与疾病复发有关。

背景介绍

有研究对389个原发性神经母细胞瘤的诊断时的样本进行新一代测序，这些发现了相对较少的体细胞突变，ALK的激活突变和ATRX的失活突变是最常见的，但这些每一个基因突变的病例不到10%。值得注意的是，这些大规模研究都没有考虑到复发时的肿瘤基因组，部分原因是患者在疾病进展时很少接受肿瘤活检，因为目前的诊断放射学技术，如间碘苄胍闪烁成像（metaiodobenzylguanidine scintigraphy）是高度敏感和特异性的。

最近，有研究对复发的神经母细胞瘤中ALK位点的测序发现，在54例(26%)样本中有14个激活突变，表明复发性神经母细胞瘤基因组中ALK异常的频率更高。这意味着肿瘤细胞的选择与基因的改变，介导神经母细胞瘤复发。因此，为了确定与复发性神经母细胞瘤相关的基因改变，本工作对23个原发肿瘤、复发性肿瘤和constitutional DNA（生殖细胞中的DNA）三联体样本进行了全基因组测序。

数据介绍

（1）对23个原发肿瘤、复发性肿瘤和constitutional DNA（生殖细胞中的DNA）三联体样本进行了全基因组测序。样本的详细信息如下表（Table 1）。23例患者中21例在复发前接受了化疗，其中8例也接受了放疗。

（2）18个细胞系神经母细胞瘤细胞系进行全基因组测序。

结果解析

01

克隆进化

首先分析了导致氨基酸变化或位于外显子3 bp内的剪接位点区域，以及包含5个或更少基因的区域的局灶性结构畸变的体细胞突变的测序数据。复发样本比在诊断时样本多14个突变（Fig. 1）。在原发肿瘤中检测到的突变中有28%在复发时也被检测到，这表明原发肿瘤和复发肿瘤具有共同的下降趋势。

为了对克隆结构有更深入的了解，接下来使用一种重新定制的Bayesian方法来评估所有体细胞突变的癌细胞分数(CCF)，该方法从测序确定的突变等位基因分数推断CCF，并考虑了污染和位点特异性拷贝数。该分析得出，在原发肿瘤中检测到但在复发肿瘤中丢失的突变的CCF中值为61%，而在原发肿瘤中与复发肿瘤共享突变的CCF中值为90%。此外，评估所有复发性肿瘤突变的CCF中值为83%，而所有原发性肿瘤突变的CCF中值为75%，这表明复发时突变子集的克隆富集。在原发和配对的复发肿瘤中，受较小的结构事件和染色体拷贝数改变影响的基因的比较显示了类似的结果，其中有一个子集的畸变是相同的（Fig. 1c,d）

02

激活RAS-MAPK信号的突变的富集

对患者的复发样本的全基因组测序数据进行无偏倚通路分析，发现了与 RAS–丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号相关的基因突变的强富集(P = 6.1×10−7)。接下来，识别了Cancer Gene Census标注的已知的突变基因，然后关注在COSMIC中标注的突变的热点区域，以识别注释到该通路的事件。23例复发样本中有15例包含符合这些标准的体细胞突变。此外，三个复发样本显示涉及RAS-MAPK通路基因的结构改变。在23例复发样本中的18例(78%)中检测到该通路的畸变，所有的改变显示通路激活（Table 2）。

全基因组测序发现10例复发肿瘤发生ALK异常，7例原发肿瘤ALK异常。所有检测到的单核苷酸变异体(SNVs)已被证实可构成性地激活该受体酪氨酸激酶，已知该激酶可激活RAS-MAPK信号。此外，一份复发样本显示，一个de novo扩增产生了PPM1G-ALK融合基因，该基因在神经母细胞瘤细胞系中表达时激活了RAS-MAPK通路。两个肿瘤显示relapse-specific 的肿瘤抑制基因NF1的失活。据报道，在神经母细胞瘤中有NF1失活的现象以及导致RAS-MAPK信号激活和维甲酸耐药。一对原发和复发肿瘤显示PTPN11杂合突变，PTPN11突变激活RAS-MAPK信号，并识别p.Ala72Thr替代突变（在白血病和成神经细胞中有报道）。一个复发的肿瘤中出现了BRAF基因串联重复，而在原发肿瘤中没有检测到。这种重排导致BRAF转录的表达，该转录编码一个具有两个激酶结构域的细长蛋白。该BRAF基因在神经母细胞瘤细胞系中的重复表达诱导了RAS-MAPK通路的激活。

基于以上，假设激活RAS-MAPK信号的突变在治疗过程中表现出复发特异性富集，所以接下来进行克隆性分析，比较配对原发(CCFp)和复发(CCFr)肿瘤中RAS-MAPK突变的CCF估计值（Fig. 2）。复发时，RAS-MAPK突变几乎普遍存在于主要的亚克隆群体中。这些结果支持RAS-MAPK突变作为体细胞驱动因子，在神经母细胞瘤治疗过程中发生阳性选择。

03

染色体变异

三例复发样本有CDKN2A基因位点的纯合缺失，该基因肿瘤抑制蛋白p14ARF和p16，而CDKN2A的两个等位基因均存在于相应的原发肿瘤中。CDKN2A缺失被报道为神经母细胞瘤复发的常见事件。还发现了其他的复发特异性节段性染色体缺陷，包括6q丢失(5例)和17p丢失(3例)。此外，还检测到在原发性神经母细胞瘤中经常发现的复发性特殊异常，这些异常与预后不良有关，包括染色体1p丢失(1例)及11q(3例)（Fig. 1c）。

04

RAS-MAPK突变对MEK抑制的敏感性

为了确定神经母细胞瘤细胞系是否包含RAS-MAPK突变，接下来分析了一系列人源的神经母细胞瘤细胞系的全基因组测序数据，18个细胞系中的11个有ALK、NRAS、HRAS、KRAS、BRAF、PTPN11和NF1突变。

接下来分析了细胞系对MEK抑制剂trametinib、cobimetinib和inimetinib的敏感性，以确定突变状态和药物敏感性之间的关系。数据显示，MEK抑制敏感性增加的细胞系分为四组：(i)无RAS-MAPK突变的细胞系；(ii)有ALK突变系；(iii)有NF1突变系；(iv)有RAS基因或BRAF突变的系。在RAS基因或BRAF突变的细胞系中，MEK抑制剂处理下导致细胞周期几乎完全停止，而在NF1-和ALK突变的细胞系中，其对细胞周期抑制的影响不太明显。当将细胞系的敏感性表达为细胞生长受到50%抑制的浓度(GI50)时，存在和不存在RAS-MAPK突变的细胞系之间存在显著差异（Fig. 3a-c）。在一组独立发表的数据中也观察到突变状态与MEK抑制敏感性之间的关系。

为了验证ALK和RAS基因突变直接激活神经母细胞瘤细胞的RAS-MAPK通路，在两个没有RAS-MAPK突变的细胞系中分别诱导ALK Phe1174Leu和NRAS Gln61Lys突变，发现任何一种突变蛋白的表达都会激活该通路。

接下来，用MEK抑制剂binimetinib治疗了上述4组类型的人神经母细胞瘤来源的细胞系异种移植模型。含有NRAS突变编码p.Gln61Lys的SK-N-AS异种移植，在给予binimetinib治疗后表现出抑制肿瘤生长和提高生存率的作用，且呈剂量依赖性（Fig. 3d）。有NF1失活突变的NBL-S异种移植也表现出抑制生长。相反，binimetinib治疗对Kelly（含有一个编码 p.Phe1174Leu的ALK替代突变）和IMR-5（没有RAS-MAPK通路突变）异种移植对肿瘤生长无影响。

接下来的试验确定了用于小鼠异种移植实验的细胞系中，细胞生长的抑制是否与RAS-MAPK通路的抑制相对应。在体外用浓度不断增加的binimetinib处理细胞系24小时，并扫描ERK磷酸化。三个RAS-MAPK突变的细胞系在未经处理的情况下ERK发生了磷酸化，这再次证实了这些突变确实导致了RAS-MAPK通路的激活。使用binimetinib后，SK-N-AS和NBL-S细胞磷酸化ERK水平呈剂量依赖性下降，而Kelly细胞无明显变化。这些数据表明，MEK抑制对Kelly细胞系在体外的最小作用和在体内的作用的缺乏可能是由于持续的ERK的磷酸化。为了确认在体内观察到的反应也是由于靶向抑制，分析了ERK在治疗反应的异种移植中的磷酸化，并证明了ERK磷酸化水平的剂量依赖性下降。

小编总结

这篇文章与我们之前介绍的几篇略有不同，没有着重分析肿瘤的空间异质和时间进化，而主要是对复发的神经母细胞瘤进行分析。首先对原发样本和复发样本的测序数据进行分析，发现大量的原发突变与复发突变有共享。在复发样本中，显示MAPK信号相关的基因突变，78%的复发样本中显示RAS-MAPK通路激活的突变。而ALK异常、NF1的失活、PTPN11杂合突变和BRAF基因串联重复都可能是导致RAS-MAPK通路的激活的原因。最后基于RAS-MAPK通路突变在复发性神经母细胞瘤中频繁发生的现象，认为RAS-MAPK通路突变可能作为难治性疾病新治疗方法的生物标志物。提出将这种通路损伤与MEK抑制等新疗法相结合，并在细胞系和异种移植实验中验证。

引用：

Eleveld TF, Oldridge DA, Bernard V, et al. Relapsed neuroblastomas show frequent RAS-MAPK pathway mutations. Nat Genet. 2015;47(8):864–871. doi:10.1038/ng.3333

END