研究癌细胞系的突变特征揭示APOBEC突变的周期性

上期精彩内容：pathwayPCA——基于主成分分析的通路分析

导语

GUIDE ╲

细胞中的每一个变异过程都会在其基因组上留下印记。利用数学方法从人类癌症成千上万的体细胞突变中已确定超过40个碱基替换和10个基因组重排突变特征。目前研究人员对某些特征的突变过程有了深入的了解，突变过程与许多疾病潜在的生物学机制有关。

APOBEC：apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like，载脂蛋白B mRNA编辑酶。APOBEC家族是催化类多肽，能够特异催化基因组中的胞嘧啶—>尿嘧啶，参与人体内免疫反应与抗病毒反应。在慢性炎症条件下，APOBEC家族表达异常，误伤人类基因组引发APOBEC突变特征。

背景介绍

癌基因组的体细胞突变目录是多种突变过程所产生的突变总和。一些突变过程可能在细胞系的整个过程中持续进行，这在癌症类型中普遍存在，在正常细胞中也存在。比较个体癌症在体内不同阶段产生的突变表明，某些突变过程在一段时间内表现出不同程度的活性。目前已发现50多种不同的突变特征，许多突变特征是外部因素引起的，其他是细胞内部因素。

为了对突变特征的生物机制进行实验研究，我们使用了一系列公开的模型来注释突变特征，包括1001个人类细胞系(COSMIC Cell Line Project)和577个癌症病人来源的异体移植(PDXs; NCI Patient-Derived Models Repository)。随后使用癌细胞系的一个子集进行实验，评估突变特征的突变过程在体外培养过程中是否持续活跃，并记录其活动的时间变化。不断获得突变特征的细胞系是未来研究突变特征潜在机制的信息模型。

结果解析

01

癌细胞系和PDX模型中的突变特征

从40多种癌症的全外显子组DNA序列中提取了单碱基替换特征(SBSs)。原发癌症中观察到的大多数SBS是在已实验的细胞系和PDX模型中发现的(Figure 1; Table S3)。与内源突变过程相关的特征也与APOBEC活性相关。最后，还观察了不确定起源的特征。

Figure 1：癌细胞系类按字母顺序为列，突变标记为行。

02

研究癌症细胞系中的持续突变

使用多种癌症的28个细胞系 (Figure 3A)来研究多范围的特征的突变过程的活性模式。

从28个肿瘤细胞系的每个细胞培养中建立一个或多个单细胞来源的亚克隆（亲本克隆），进一步得到一个或多个单细胞亚克隆(Figure 2)，为子克隆。将亲代克隆和相关子克隆的突变进行相减，得到所需要的突变集。然后生成了100个全基因组和41个全外显子序列的子克隆以及相应的58个亲本克隆的特征图谱(Figure 3)。

Figure 2 ：在一段时间内追踪获取癌症细胞系的突变

Figure 3 ：人类癌细胞突变过程（A-C）柱状图表示在培养基细胞系中由于突变特征和indel而导致的碱基替换的数量，以及各自的亲本(B)和子代克隆(C)。

培养基细胞系中存在的某些突变特征，在其后代克隆的体外培养过程中并没有产生(Figure 3)，其他特征在培养某些细胞系的后代克隆时继续产生。

多个突变特征 (SBS6, SBS14, SBS15, SBS20, SBS21, SBS26)被认为与错配修复（MMR）缺陷有关。

2.1 APOBEC相关特征SBS2&SBS13的活性

SBS2和SBS13与APOBEC活性有关，并在癌症中很常见，但其激活的因素未知。SBS2和SBS13在TCN三核苷酸上胞嘧啶的取代，SBS2主要特征为C>T突变，SBS13为C>G和C>A突变。

在体外试验中，SBS2和SBS13的获得率在癌细胞系之间、同一癌细胞系的不同子系之间、以及同一子系中，随着时间有很大的变化 (Figure 3)。8个细胞系中APOBEC活性显著，可检测到SBS2和SBS13持续生成。SBS2和SBS13突变可以在短时间、剧烈的活动爆发中产生，但会有长时间的沉默期，这种模式称之为“偶发突变”。

在个体细胞系的不同阶段，也观察到APOBEC相关突变的数量波动。大多数APOBEC活性的癌细胞系在特征序列上表现为C>T，C>G和C>A突变 (Figure 4)。

在人类癌症中，APOBEC是SBS2和SBS13的来源。

Figure 4：序列克隆揭示了APOBEC突变的片段性。（A-E）在连续时间内，在五个癌细胞系中获得的碱基替换的模式。

03

Kataegis是在体外培养过程中产生的

在体外培养中大多数由APOBEC突变引起的突变都大致均匀地分布在基因组中，这与一般在体内癌症中观察到的模式相同(Figure 5A)。在一些细胞系的体外培养过程中也获得了局部性APOBEC相关高突变的病灶Kataegis（分子生物学中，Kataegis是癌基因组中发现的局部超突变模式。），主要发生在SBS2和SBS13的全基因组克隆中，并且在具有更高的全基因组突变率的样本中具有更多病灶(Figure 5)。

Figure 5：体外产生APOBEC相关突变Kataegis的全基因组和局部病灶。（A）Circos图描绘了在试管内获得的样本子代或三代克隆的突变。（B）条形图显示了来自指定细胞系的100个全基因组测序的子代和三代克隆的体外获得Kataegis病灶频率和APOBEC相关特征(SBS2和SBS13)的总负担。

3.1 APOBEC相关突变特征SBS2&SBS13的起源

目前寻找导致癌症中SBS2和SBS13突变的特定APOBEC家族成员是一个热点。人类癌症中SBS2和SBS13突变主要发生在APOBEC3A诱导突变的序列。体外培养癌症细胞系中产生的SBS2和SBS13突变，大量富集于YTCN / YTCA（Y代表嘧啶）序列，与主要由APOBEC3A介导的偶发突变一致 (Figure S4C)。

04

APOBEC中持续突变流行

在建立了培养基细胞系的最近的共同祖先之后，某些细胞系中某一时刻发生了APOBEC突变，为了确定这样的细胞系的比例，对16个癌症细胞系的32单细胞进行WGS ，主要关注六个特征 (Figure 6B)。突变特征揭示了POLE相关的SBS10a-b/SBS28和SBS4分别只存在细胞系ESS-1和G-292-clone-A141B1中 (Figure 6A)。在细胞系(CAL-27 and JSC-1)单细胞中识别出APOBEC相关的特征，但在子宫颈细胞系SiHa的单细胞中APOBEC突变从未出现(Figures 3 and 6A)。此外，在肺腺癌细胞系NCI-H2087的单细胞中未检测到与吸烟相关的SBS4，但该特征在培养基序列中存在 (Figure 6A)。因此，在单细胞中检测到的突变特征表明APOBEC还在继续突变。

Figure 6：单细胞的突变特征表明了APOBEC相关的持续突变。（A）条形图表示全基因组排序的细胞系及其单细胞中碱基替换的数量(左)和突变特征(右)。（B）从36个全基因组测序单细胞的完整突变目录中提取突变特征。

小编总结

本工作使用癌症细胞系和PDX模型进行实验来探索与大多数突变特征背后的突变过程有关的技术性问题。

SBS2和SBS13在人类癌症有较高普及率，APOBEC相关的SBS2和SBS13可以在单个癌症进化过程中的多个时间点产生。

进一步发现，随着时间的推移，APOBEC相关的突变表现出高度波动的突变率，在体外是断断续续的，在短时间爆发和长时间的无活性。这种偶发突变在体内发生的程度有待进一步研究。

1. 关键资源表

2. 用SigProfiler (v. 2.1) and SigProfilerSingleSample (v. 1.2)识别突变特征并在细胞系上注释突变特征。

REF：Petljak M, Alexandrov LB, Brammeld JS, et al. Characterizing Mutational Signatures in Human Cancer Cell Lines Reveals Episodic APOBEC Mutagenesis. Cell. 2019;176(6):1282‐1294.e20. doi:10.1016/j.cell.2019.02.012