【单细胞文献解读】靶向治疗诱导肺癌进化

导语

GUIDE ╲

肺癌是全球范围内发生率和死亡率最高的恶性肿瘤，而远端转移是肺癌致死率的主要原因。靶向治疗虽然可以延缓部分患者的生命，但肺癌的异质性仍会导致肿瘤细胞适应新环境，出现耐药。只有了解治疗前后肿瘤和微环境的进化过程以及异质性，才能更好指导靶向用药，改善治疗疗效。

背景介绍

单细胞技术是当今科学研究的'super star'，它可以提供更丰富、更精确的内容。而目前关于单细胞的研究大多数还停留在绘制肿瘤单细胞图谱上，而在临床中应用中的研究较少。今天小编和大家分享一篇单细胞应用于临床的研究，于2020年8月发表在Cell (IF:38.637)上，探索靶向治疗前后肺癌的进化。

数据介绍

入组：30例肺癌患者，共49个组织样本，并进一步将样本分为如下三类：

• TN--未接受靶向治疗的样本
• RD--对靶向治疗后有响应的样本
• PD--经靶向治疗后获得性耐药的样本

测序平台：SMART-Seq2

结果解析

01

晚期NSCLC的单细胞全景图

49个晚期NSCLC样本（3个癌旁、45个非腺癌、1个肺鳞癌），共获得23,261个细胞，聚类成三类细胞：免疫细胞、基质细胞（包括成纤维细胞、内皮细胞、黑素细胞）以及上皮细胞。

02

利用单细胞转录组数据推测拷贝数变异，进而区分癌和非癌细胞

癌症通常会伴随着大规模的染色体水平变异，作者基于单细胞RNA表达数据来推测拷贝数变异(CNV)，并进一步区分出癌细胞和非癌细胞，发现：

• 癌细胞中，有大片段染色体内的基因同时高表达或低表达，而成纤维细胞与内皮细胞则没有。
• 癌细胞比非癌细胞整体表达水平更高。
• 通过无监督的聚类分析，发现来源于正常组织中的细胞(紫色)与癌细胞聚成不同的类。
• 大多数的癌细胞簇都是来自特定的患者，而患者之间share的癌细胞较少，反映了个体之间肿瘤分子的异质性。

03

利用单细胞转录组识别突变事件，揭示癌细胞的复杂性

利用单细胞转录组，在癌细胞中识别突变。

基于单细胞转录组数据，识别到了一些临床上常见的driver基因突变，同时，在一些样本中还鉴定出了新的突变。

04

比较TN和RD

• RD比TN呈现更高的肺泡signature(图A)。
• 通过RT-PCR的正交验证，发现肺泡的标志性基因NKX2-1在RD中表达高于Control组和获得性耐药的细胞，说明在RD组中肺泡信号被激活（图B）。
• 通过免疫组化验证肺泡的另一个标志性基因AQP4，在RD样本的质膜诱导了AQP4蛋白表达（图C），而在TN和PD组AQP4则没有表达。
• 利用外部TCGALUAD RNASeq数据，发现这些肺泡生物标记物的高表达可以改善患者的总体生存（图D）。
• 在早期使用TKI药物、同时抑制WNT/β-catenin信号通路，可以减少细胞的融合度，提高药物的响应程度（图G-J）。

05

比较TN和PD

• PD组呈现更高的犬尿氨酸signature(图K)，该途径的IDO1，KYNU和QPRT基因表达明显升高，这些基因的高表达会引起免疫抑制的行为，说明PD肿瘤内的癌细胞可能直接抑制免疫系统的活性。
• 利用TCGA的LUAD RNASeq数据分析，发现在肿瘤患者中，犬尿酸signature的高表达预示着总体生存较差(图M)。

06

比较RD和PD

• 比较RD组和PD组的癌细胞转录组，发现了PD组过表达的基因参与了侵袭、细胞间通讯、分化以及免疫调节等功能。
• 在PD组中，发现纤溶酶原激活途径中的几个基因(ANXA2, PLAT, PLAUR, PLAU)以及纤溶酶原抑制剂SERPINE1(PAI1)同时高表达(图N,图O)。
• 利用TCGA的LUAD RNASeq数据分析，发现纤溶酶原激活Signature高表达组中，患者的总生存OS更差(图P)。
• 利用TCGA的LUAD RNASeq数据分析，发现纤溶酶原抑制剂SERPINE1高表达的组中，患者的总生存OS更差(图Q)。
• PD组中呈现更高的间隙蛋白Signature(图R)。
• 利用TCGA的LUAD RNAseq数据分析，发现间隙蛋白GJB2/3/5的高表达表现出较差的预后(图S)。

05

对一例多时点的患者进行单细胞追踪分析

对来自同一患者的TN,RD, PD样本进行分析，来探索靶向治疗期间肿瘤微环境的演变，发现：

• 在PD中高表达了很多鳞状细胞分化相关的基因(KRT16, KRT14, KRT6A, KRT5, CLCA2, PKP1, ANXA8, DSG3)，说明在PD阶段表现出部分鳞癌的特征，该患者的肿瘤活检中也显示由前期的纯腺癌在后期转变为鳞状细胞癌。

08

靶向治疗期间肿瘤微环境的改变

• 对所有的免疫细胞(n =13,431)进行聚类和注释分析，共获得9个免疫细胞亚型(图A-B)。
• 比较TN-TD-PD三组之间各个免疫细胞的变化，发现在所有治疗节点，T细胞和巨噬细胞都是细胞数目最多的亚群 (图C)。
• RD期间浸润了较多的T淋巴细胞，以及较少的巨噬细胞 (图C)。
• 对TCGA的LUAD RNAseq数据进行去卷积来预测免疫细胞浸润情况，发现巨噬细胞浸润较高的分组中患者的总生存OS更差。

09

巨噬细胞亚群和T细胞亚群在不同治疗阶段特点

巨噬细胞(n= 1,379)进一步聚类，细分成5个亚群，并进行marker基因的注释(图A-B)。

• MF0：在 靶向治疗之前--TN 富集，且表达了与免疫抑制表型相关的基因(C1QC，GPNMB，APOE，TREM2，FOLR2)。
• MF1：在 靶向治疗响应期--RD 富集，表达了一些髓系来源的抑制细胞marker (FCN1，VCAN，S100A8，S100A9) 以及炎症的消退、伤口愈合和抑制IL-1b的基因 (THBS1 and PTX3)。
• MF2：在 疾病进展期--PD 富集，表达了一些促炎因子(CXCL9，CXCL10，CXCL11)，同时也在PD期特异性表达了IDO1。
• MF3：在靶向治疗响应期 (RD) 富集，表达了与组织损伤的促炎反应相关基因(CLEC2D，IL7R，OGT)，以及促进炎症信号传导的基因(FYN，DUSP4，FOXO1)。
• MF4：在靶向治疗的三个时间节点上无明显规律，该cluster表达了增殖的髓系细胞基因(TOP2A, MKI67)。

T/NK细胞(n = 2,226)进一步聚类，细分成5个亚群并，进行marker基因的注释(图C-D)。

• 在RD肿瘤中，T细胞总体比例较高(图4C)，且没有单个T细胞亚簇在RD中富集。
• TC0：在 靶向治疗之前--TN 富集，表达了与naïve-like CD8+表型相关的基因(CCR7, IL7R, SELL)。
• TC1：在 疾病进展期--PD 富集，表达了一些功能失调或耗竭型的marker (PDCD1, CTLA4)。
• TC2：在 疾病进展期--PD 富集，表达了Treg相关的基因 (FOXP3, IL2RA)。
• TC3：在每个治疗节点都存在，在疾病进展期—PD轻微富集，同时表达了毒性基因(CD8, GZYMA) 以及PDL1/CTLA4， 可能代表了一个杀伤功能失活之前的T细胞亚群。
• TC4：在 靶向治疗之前--TN 富集，表达了NK细胞或NKT细胞的marker基因(KIR2DL3, FCGR3A)以及T细胞的marker基因(CD3, CD8)。

小结：

• TN和PD中浸润较多的巨噬细胞，其中PD主要浸润的是IDO1+ macrophage以及免疫抑制作用的T细胞（如：Treg细胞）（图E），而TN浸润较多的M2-like巨噬细胞。
• RD中浸润着较多的T细胞，但免疫抑制类型或功能失调类型的T细胞较少，抑制性的巨噬细胞浸润也较少。

小编总结

这是一篇典型的单细胞应用于临床场景的研究。在课题设计上，将焦点放在：在靶向治疗前(TN)，靶向治疗后有效果(RD)、靶向治疗后进展(PD)三个阶段的样本中，进一步比较三者之间上皮细胞、免疫细胞的特征，绘制靶向治疗前后TN->RD->PD的细胞进化谱和肿瘤微环境，探索耐药原因，进一步指导患者的治疗。

MaynardA, McCoach CE, Rotow JK, et al. Therapy-Induced Evolution of Human Lung CancerRevealed by Single-Cell RNA Sequencing [published online ahead of print, 2020Aug 7]. Cell. 2020;S0092-8674(20)30882-5. doi:10.1016/j.cell.2020.07.017