热点碰撞--m6A与免疫微环境研究分析思路!

导语

GUIDE ╲

最近的研究证明了免疫反应会受到表观遗传调控，尽管如此，RNA的m6A修饰在肿瘤微环境(TME)细胞浸润中的潜在作用尚不清楚。

背景介绍

m6A甲基化和免疫微环境都是近两年研究的热点，当两者发生碰撞时会发生什么呢？

今天，小编给大家带来了胃癌中m6A与免疫微环境分析相关思路，这篇文章于2020年3月发表在《Molecular Cancer》期刊上，影响因子15.302，题目为:m6A regulator-mediated methylationmodification patterns and tumormicroenvironment infiltrationcharacterization in gastric cancer。

数据介绍

TCGA：从GDC获取TCGA-STAD数据集（将FPKM转换为TPM），以及体细胞突变数据

GEO：GSE15459、GSE34942、GSE57303、GSE62254/ACRG、GSE84437、GSE26253的CEL文件

拷贝数变异数据：来自ACRG队列的GSE62717数据集

结果解析

01

胃癌中m6A调节因子遗传变异研究

本研究确定了21个m6A调节因子，包括8个writers、2个earsers和11个readers。首先总结了由调节因子介导的m6A甲基化的动态可逆过程以及它们的潜在生物学功能（Fig.1A)

作者统计了在胃癌的433个样本中，21个m6A调节因子的拷贝数变异和体细胞突变的发生率，有101例发生m6A调节因子突变，突变频率为23.33%，其中ZC3H13突变频率最高，其次是KIAA1429（Fig.1B）。

对CNV研究显示，在21个调节因子普遍发生CNV变化，大多数发生拷贝数的增加，而ELAVL1、YTHDF2和FMR1主要发生CNV缺失(Fig.1C)。

m6A调节因子CNV改变的位置如Fig.1D所示,根据21个m6A调节因子的表达，可以区分胃癌样本和正常样本(Fig.1E)。

与正常的胃组织相比，发生CNV增加的m6A调节因子在GC组织中表现出更高的表达（CBLL1和FTO)（Fig.1F）

Fig.1

02

由21个调节因子介导的m6A修饰模式及TME细胞浸润特征

使用5个具有OS数据和临床信息的GEO数据集（GSE15459、GSE34942、GSE57303、GSE62254/ACRG和GSE84437），通过单因素Cox回归模型显示了胃癌患者中21个m6A调节因子的预后水平。用m6A调节因子网络描述了m6A调节因子的相互作用、及其对GC患者的预后意义(Fig.2A）。

基于21个m6A调节因子的表达水平，使用R包ConsensusClusterPlus根据m6A修饰模式分类不同的患者，最终识别到3种不同的修饰模式，包括模式A：389例，模式B：348例和模式C：322例。将这些模式分别称为m6Acluster.A-C，对这三种主要的m6A修饰模式的样本进行预后分析，发现clusterB具有显著的生存优势(Fig.2B）。

为了探索不同的m6A修饰模式对应的生物学功能，作者进行了GSVA富集分析。m6Acluster.A明显富集了基质和致癌激活通路，如ECM受体相互作用、TGF信号通路、细胞粘附和MAPK信号通路。m6Acluster.B富集了与免疫完全激活相关的途径，包括趋化因子信号通路的激活、细胞因子-细胞因子受体相互作用、T细胞受体信号通路和Toll样受体信号通路(Fig.2C)。而m6Acluster.C与免疫抑制的生物学过程有显著的关系（Fig.2D)。

随后对TME细胞浸润的分析表明，m6Acluster.A具有丰富的先天免疫细胞浸润，包括natural killer cell、macrophage, eosinophil, mast cell, MDSC,plasmacytoid dendritic cell(Fig.3A）。

分析表明，基质在cluster.A中的活性显著增强，如激活上皮-间充质过渡(EMT)、转化生长因子beta(TGFb)和血管生成途径（Fig.3B）。

03

在ACGR数据集分析m6A甲基化修饰模式

为了探究这些m6A修饰表型在不同临床特征中的作用，作者使用了包含300名胃癌患者的ACRG数据集，数据集包含全面的临床注释。与之前的结果类似，无监督聚类也在ACRG队列中发现了三种完全不同的m6A修改模式(Fig.3C、D)。

大多数EMT亚型患者聚集在m6A cluster.A，而m6A cluster.B中几乎没有EMT亚型，这再次证实m6A cluster.A与基质激活显著相关，m6A cluster.B与免疫激活相关（Fig.3E）。

作者使用limma包确定了718个m6A表型相关的差异表达基因，对DEGs进行GO富集分析，发现这些基因在m6A修饰和免疫显著相关的生物过程中显著富集，证实了m6A修饰在肿瘤微环境中的免疫调节中发挥了不可忽视的作用（Fig.3F)。

04

m6A基因特征的生成和功能注释

为了验证这种调节机制，作者对获得的718个相关基因进行无监督聚类，与m6A修饰模式的聚类分组一致，无监督聚类也揭示了三种不同的m6A修饰基因组表型，将这三个集合分别命名为m6A gene cluster A-C(Fig.4A）。

300例胃癌患者中的88例聚集在gene cluster A中，与更好的预后有关。而gene cluster C中的患者（105例）的预后较差(Fig.4B）。

在三个m6A gene cluster中，观察到m6A调节因子表达的显著差异，这与m6A甲基化修饰模式的预期结果一致(Fig.4C)。

考虑到m6A修饰的个体异质性和复杂性，基于这些表型相关基因，构建了一套评分系统来量化胃癌患者各自的m6A修饰模式，称为m6A score(Fig.4D)。

为了更好地说明m6A signature的特征，还计算了已知signature与m6Ascore之间的相关性(Fig.4E）。

Kruskal-Wallis test显示，m6A gene cluster在m6A评分上有显著差异。gene clusterA中位数得分最低，而gene clusterC中位数得分最高，这表明低m6Ascore可能与免疫激活相关特征密切相关，而高m6Ascore可能与基质激活相关特征相关(Fig.4F)。

更重要的是，m6A clusterA与其他cluster相比，m6Ascore显著增加，m6A clusterB中最低(Fig.4G)。对基质相关通路活性的分析表明，高m6Ascore与基质通路的激活增强显著相关(Fig.4H)。

与其他三种ACRG分子亚型相比，EMT亚型患者的m6A score最低(Fig.5A)。为了进一步确定m6Ascore的预后价值。根据survminer包确定的cut-off值0.0291，将患者分为低m6A或高m6A组。m6A score低的患者具有显著的生存优势（Fig.5B），5年生存率是高m6A score患者的两倍（69.4%和33.5%）。并且发现低m6A score的患者在同样接受辅助化疗的患者中具有显著的治疗优势(Fig.5C)。

05

TCGA分子亚型的m6A修饰特征及肿瘤体细胞突变

在TCGA数据集中，将胃癌分为四种不同的分子亚型，包括基因组稳定(GS)、微卫星不稳定(MSI)、EBV和染色体不稳定性(CIN)。作者评估了这些分子亚型之间的m6A score的差异。高m6A score明显集中在GS亚型，患者生存率差，低m6Ascore集中在MSI和EBV亚型，与较好生存率相关（Fig.5D、E)。预后更好高微卫星不稳定性亚型与较低的m6A score显著相关，而MSI-Low和MSS有较高的m6A score(Fig.5F)。

然后分析了TCGA-STAD队列中低m6A score和高m6A score之间体细胞突变的分布差异(Fig.5G、H)。低m6Ascore组比高m6Ascore组肿瘤突变更大，其突变率分别为25%和10%。TMB定量分析证实，低m6Ascore肿瘤与较高的TMB显著相关，有证据表明，高TMB状态的患者对抗PD-1/PD-L1免疫治疗具有持久的临床反应。因此，上述结果间接证明，肿瘤m6A修饰模式的差异可能是介导抗PD-1/PD-L1免疫治疗的临床反应的关键因素。而m6A评分在预测免疫治疗结果方面的价值也被间接证实。

06

m6A修饰模式在抗PD-1/L1免疫治疗中的作用

以PD-L1和PD-1阻断为代表的免疫疗法已成为癌症治疗的重大突破。作者基于两个免疫治疗队列，研究了m6A修饰特征是否可以预测患者对免疫检查点阻滞治疗的反应。

在抗PD-L1队列（IMvigor210）和抗PD-1队列（GSE78220）中，低m6Ascore的患者都具有显著的临床疗效，并且显著的延长了生存率（Fig.6A-G)。此外，低m6Ascore患者的PD-L1明显高表达，这表明在对抗PD-1/L1免疫治疗中有潜在的反应(Fig.6H)。进一步的研究表明，调节性T细胞和TME基质在高m6A的肿瘤中显著激活，介导肿瘤的免疫耐受（Fig.6I)。

小编总结

本研究基于21个m6A调节因子，区分了三个不同的m6A甲基化修饰模式，这三种模式具有明显不同的TME细胞浸润特性。并且不同的m6A修饰模式之间的mRNA转录组差异与m6A和免疫相关的生物途径显著相关。作者建立了m6A score评分系统来评估每个胃癌患者的m6A修饰模式，在预测免疫治疗结果方面具有重要价值。