【单细胞文献解读】溃疡性结肠炎CD8+T细胞的单细胞图谱

导语

GUIDE ╲

有抗原经验的结肠淋巴细胞，如组织驻留记忆CD8 + T细胞，会在下一次抗原暴露时迅速反应。然而，它们的细胞表型以及驱动免疫调节和炎症的机制尚不清楚。

背景介绍

今天小编给大家分享的是一篇由英国牛津大学的Alison Simmons、Hashem Koohy等研究人员合作发表于Nature Medicine的文章。

这项工作基于单细胞转录组学及质谱流式细胞技术，对健康人及溃疡性结肠炎（UC）患者的结肠CD8+ T细胞进行了分析，对比了患者与健康人结肠中各CD8+ T细胞亚群在比例及功能上的差异。

数据介绍

对3名健康人与3名UC患者的结肠CD8+T细胞进行单细胞转录组测序，共获得8,581 个细胞。

测序平台：10x Genomics。

结果解析

01

人结肠CD8+T细胞状态的拓扑结构

本研究使用基于液滴的单细胞RNA测序(scRNA-seq)对三名健康志愿者和三名UC患者的结肠单个CD8+T细胞进行了分离(图1A)，收集了8581个细胞的基因表达数据，用于聚类分析，可以分成14个细胞亚群(图1B)。

获得如下细胞类型：初始T细胞、记忆T细胞、组织驻留的记忆T细胞(TRM)、效应T细胞、双阳性(DP)T细胞、MAITs 、上皮内淋巴细胞(IELs) 和IL26+CD8+T细胞(图1C,D)。

通过GO富集分析(图1E)，进一步研究了亚群特异的基因功能，在双阳性(DP) T细胞和IL26+细胞中发现了IL-17途径的局部活性；上皮内淋巴细胞亚群和一些IL26+T细胞富集了自然杀伤(NK)的功能(图1F)。

小结：描绘了结肠CD8+T细胞的异质性，包括具有固有性和适应性特征的IL26+细胞和DP调节性CD8+T细胞。

02

溃疡性结肠炎结肠CD8+T细胞的动态重构

作者观察到溃疡性结肠炎患者CD8+T细胞亚群变化较大，例如，组织驻留的记忆T细胞（TRM）平均占健康恢复细胞总数的45%，但仅占CD8+细胞总数的约10%。还观察到双阳性(DP) CD4+ CD8+ FOXP3+T细胞数量在UC中增加，natural TYROBP+在UC中减少，TYROBP-IEL在UC中增加(图2A)。

此外，在这些亚群中，作者鉴定了997个差异表达基因，这些差异基因激活了TCR信号通路、抗原呈递过程、以及PD1和CTLA4通路(图2B)。并且发现，UC相关位点(GWAS)的基因在活性炎症中特异性表达(图2C)。在上皮内淋巴细胞(IEL)和IL26+T细胞中发现了整体的信号水平较高，这是由包括KIR3DL2(Rs17771967)在内的基因的特异性高表达所驱动的(图2C，D)。

非经典MHC分子HLA-E9在溃疡性结肠炎的多种上皮亚群中被诱导，而其相应的配体在CD8+T细胞中被诱导。在CD8+T细胞中，发现了谱系特异性细胞的相互作用，如IL18-IL18R1/IL18RAP和TNF-TNFRSF1A，只在吸收细胞和多个CD8+亚群之间互作，而在分泌型的细胞则不出现(图2D，E)。

03

UC中调控结肠CD8+可塑性的转录网络

为了明确炎症性结肠CD8+T细胞的调控网络，作者进行了基因共表达分析，对转录因子(TF)顺式调控的共表达基因进行活性评估，鉴定出273个活跃的TF活性相关circuits。层次聚类发现了只在特定T细胞亚群中表达的网络(图3A)。

通过伪时间分析绘制线性进化轨迹: 从初始T细胞 到记忆T细胞、组织驻留的T细胞(TRM)、GZMK+效应T细胞，最后到IL26+细胞(图3B，C)。

为了筛选驱动伪时间变化的基因，作者对所有差异表达的基因进行聚类(图3D)，并识别了早、中、晚表达的基因集合。在初始T细胞和早期的中枢记忆T细胞中CCR7表达较高，而共抑制受体(HAVCR2，CTLA4)在晚期表达较高(图3D，E)。并且发现，随着共抑制分子的逐渐增加，T细胞激活标志物有很强的信号。同时随着BATF、CTLA4、HAVCR2、LAYN和TNFRSF9的表达增加，而与效应T细胞功能相关的分子(如GZMK)，则稳步丢失(图3C-E)。

初始T细胞、MAIT和双阳性（DP） T细胞群体表现较高的克隆多样性，大多数细胞表达独特的TCR CDR3序列(图3F)。在健康结肠的CD8+细胞中，组织驻留的T细胞（TRM）富集了最高的T细胞克隆(图3G)。

小结：3835个独特的T细胞克隆类型中，有320个克隆出现在至少一个cluster中，共有2438个细胞与其他亚群中的细胞共享克隆类型(图3H)。作者检查了不同亚群共有的TCR克隆类型及其重叠程度，观察到TRM亚群中的克隆存在于许多其他细胞类型中。(图3H)。

04

结肠CD8+T细胞的多组学分析证实了UC的异质性和重塑性

为了在蛋白质水平上验证单细胞特征，作者接下来通过测序(CITE-seq)结合cell hashing技术，整合了另外9,062个细胞的转录和蛋白质组数据(图4A，B)，制备了另外7个UC和5个健康样本。

发现scRNA-seq和随后的CITE-seq分析之间具有很高的重复性(图4B-D)。能够将效应细胞分为两个额外的亚群，其特征是表达TNF(TNF+效应器)和EGR1/EGR2(EGR1+效应器)(图4B)。

使用CITE-seq将一个由14个蛋白质的表达映射到所有CD8+细胞亚群(图4E、F)。

小结：共抑制分子PD1、TIM3和LAG3主要标记CD103+细胞等，少数CD103-细胞在蛋白水平上表现出慢性T细胞刺激的特征(图4E，F)。

05

UC重塑CD8+T细胞的数据整合与功能分析

作者开发了一种整合39个细胞特异性标记基因的质谱流式（CyTOF）。以CyTOF数据为参考，接下来进行了多模态单细胞数据整合，以推断两种表达模式之间最可能的对应细胞(图5A，B)。许多关键标记在蛋白质和mRNA水平上共表达(图5C，D)。

为了评估UC相关CD8+亚群的功能，作者用佛波酯(PMA)和离子霉素进行了体外刺激。使用CyTOF分析了刺激后健康供体(n=4)和UC炎症患者(n=3)的细胞。两组样本均产生了表达肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的CD103+TRM细胞亚群。相反，来自UC患者的重新激活的细胞也富集了GZMK+效应标志物(图5E-G)。

06

IL-26可减轻急性结肠炎的严重程度

作者使用人源IL-26转基因(hIL-26Tg)小鼠模型来评估IL-26是否可以影响急性结肠炎的严重程度。

将hIL-26Tg小鼠和对照B6小鼠的饮用水中加入2.5%的葡聚糖硫酸钠(DSS)，并在第0天和第3天分别用抗IL-26单克隆抗体(MAb)或对照mAb处理hIL-26Tg小鼠(图6A，B)。

DSS-challenged的WT小鼠的炎症得分显著高于给予对照抗体的DSS-challenged的hIL-26Tg小鼠。在这些hIL-26Tg小鼠中，注射抗IL-26单抗后DSS的炎症效应得以恢复(图6C，D)，表示IL-26在炎症急性期有潜在的保护作用。

为了研究IL26表达的影响，接下来对DSS的结肠组织进行RNA-seq分析。主成分分析(PCA)表示DSS与对照(图6E)的RNA-seq图谱之间存在明显差异。在WT和hIL-26Tg小鼠之间确定了295个显著(<5%FDR)的差异表达基因(图6F)。

接下来，比较了WT和TG小鼠在DSS条件下的RNA-seq数据，确定了473个差异表达基因(图6G)。在hIL-26小鼠中，观察到免疫反应相关转录本的表达明显减少(图6G-I)。

小结：IL-26在急性结肠炎中具有免疫调节作用，这种作用可能和细胞因子对粘膜损伤具有促进作用有关。

小编总结

作者绘制了健康和溃疡性结肠炎（UC）样本中结肠CD8+T细胞图谱。揭示了CD8+T细胞组成中广泛的异质性，包括扩增的效应子和效应子后分化的CD8+T细胞。UC相关的CD8+效应T细胞可以触发组织破坏并产生肿瘤坏死因子（TNF）-α，而效应T细胞则具有先天的特征，可以采取调节功能来减轻过度的炎症反应。

作者确定了健康和UC样本中的结肠CD8+T细胞表型，定义了它们的克隆关系，并说明：对于分化功能障碍型的UC CD8+T细胞，IL-26的表达可以减轻人源急性结肠炎症状。