临床样本怎样简单生信分析？对肝细胞癌建立分子和免疫分型

Comprehensive molecular and immunological characterization of hepatocellular carcinoma

IF：6.68

EBioMedicine

临床上肝细胞癌（HCC）的治疗有复发率高的现象，包括肝内原发肿瘤转移和 multi-centric复发。并且HCC相关的分子亚型与临床病理学特征的关联研究仍不全面。

本工作对两个HCC数据集根据分子特征分成三种亚型，并在原发肿瘤和转移肿瘤中探究亚型特征。

一、基于转录组分型

（1）183个HCC的芯片数据，肿瘤和正常组织找差异基因（上调、下调），以及在样本中表达值波动较大的基因共938个

样本来源：Tokyo Medical and Dental University (TMDU) Hospital

（2）无监督聚类，分成A、B两组

（3）富集分析（GSEA）

Group A:有丝分裂活性

Group B:细胞代谢

（4）比较临床特征

Group A:携带肝炎病毒 (p = .002)

Group B:肥胖和糖尿病 (p = .045 and 0.012)

（5）生存分析：Group A生存差

二、 整合外显子组、甲基化和转录组

（1）分别在A、B组随机选择17个和16和患者，进行全外显子组测序，每组识别9个特异突变基因。发现基因只在Group B突变的CTNNB1基因，是排名第一的A、B组显著差异基因，并且CTNNB1是已知的HCC驱动基因。

将33个样本重新分3组：①等同于Group A （MS1）②Group B有CTNNB1突变（MS2） ③Group B没有CTNNB1突变（MS3）

（2）甲基化测序：MS2高甲基化，可能是由于β-catenin 和DNA 甲基转移酶 DNMT1 蛋白互作。

（3）GSEA

MS1:有丝分裂

MS2: Wnt/β-catenin 通路

MS3：IL6/STAT3 and TNFα/NFκB 的炎症应答

（4）三组的临床特征

MS1:肝炎病毒感染

MS3：肥胖、糖尿病和血脂异常的代谢风险因子

三、用公共数据集验证分型

（1）TCGA 373 HCC样本mRNA表达数据，进行层次聚类。938个差异基因能够将样本分成两类Group A、 B。全外显子组测序识别58个Group B有CTNNB1突变，继续分成MS1, MS2 和MS3 三种亚型

（2）识别49个三组差异突变基因。

拷贝数变异分析：MS1有大量拷贝数变异，说明染色体不稳定。三种亚型中都发现TERT扩增和CDKN2A缺失。MS2、MS3中肿瘤抑制基因MACROD2 和 ACVR2A缺失。

甲基化分析发现MS2超甲基化

（3）临床病理学特征：TCGA结果与TMDU结果有高一致性，

四、与其他分子分型的比较分析

（1） 过去二十年的HCC分子分型主要有这几个工作：Lee，Hoshida，Boyault 和Chiang's

（2） 下图展示本研究的TMDU数据分型、TCGA数据分型与上述几种分型比较情况，以及用TCGA数据分型与TCGA的 iCluster分型的比较情况。

TMDU数据中Group A与Lee's分型中的SURVIVAL_DN型，Hoshida's分型中S1和S2型，Boyault's分型中的G1/2 型和 G3 型的一致性高。

相比TCGA iCluster分型，本工作方法与上述四种分型的相关性高

下图展示每种亚型的特性

携带TP53突变的MS1展现高度的有丝分裂活性，从而引发染色体不稳定和类干细胞性能，与高血清AFP水平、血管侵袭、不良预后相关；MS2中CTNNB1突变激活 Wnt/β-catenin通路导致超甲基化；MS3的患者有转移风险因子，并通过 TNFα/NFκ通路增加炎症应答。

五、基于免疫表达谱分型

（1）TMDU数据集，计算免疫相关基因（Sia D, et al.）的 aggregate scores （Robinson DR, et al. Nature 2017;548(7667):297–303.），进行层次聚类，将有炎症状况和免疫细胞存在的一类为免疫类别。

（2）层次聚类

TMDU数据集，所有样本中有 42%是免疫亚型，而免疫亚型中的90%是MS3分型

TCGA验证集，所有样本中有38%是 42%是免疫亚型，显著富集在MS3分型

（3）将MS1、MS2、MS3三种亚型每种划分为免疫和非免疫性，生存分析，MS3型中免疫样本比非免疫样本生存好（p = .003）

MS3型进而划分为MS3i（免疫） 和 MS3n（非免疫），MS3i比MS1、MS2、MS3n生存好。

（4）比较分子分型和免疫分型

（Thorsson V, et al. Immunity 2018;48(4):812–30）工作的分型C1/C2 (wound healing/IFNγ dominant), C3 (inflammatory) 和 C4 (lymphocyte depleted)分别与 MS1, MS3i和 MS2/MS3n相关。C1有有丝分裂活性和染色体不稳定，与MS1相相似；C3有好的预后，带有MS3i类的特点

（5）CIBERSORT方法对样本去卷积，发现 MS3i有高的免疫细胞cumulative scores 。

MS3i中M1 和M2巨噬细胞浸润激活显著高，CD8+ T细胞在MS2 和 MS3n中显著少。

六、肿瘤复发过程中表型亚型的遗传特征

对来源于18个患者的18个原发和19个复发肿瘤进行全外显子组测序。

根据突变模式（单核苷酸变异和框移）划分成两类样本：一类是在 HCC中有较多的肝内转移的突变(gIM)，另一类是多病灶HCC突变（gMC）

gIM pairs比gMC有高的β-values（代表CPG位点的甲基化水平） 相关性，该现象支持来源于同一起源的肿瘤会继承相同的甲基化模式，也说明由于区域性癌变（field cancerization），即使在相同背景下发展的多病灶肿瘤在表观遗传特征方面也可能彼此相似。

将原发肿瘤和复发肿瘤分成三种亚型。复发HCC与原发有相同的亚型，但是gIM/gMC与亚型无关。说明HCC分子分型受外在条件如肿瘤微环境的约束。（不仅仅是会受基因因素如突变的影响）

小编总结：

本工作的优势是有自己的肿瘤样本，生信部分的分析比较简单，基于差异基因聚类分型，与临床特征比较，与其他分型方法比较，联系免疫分型。所以如果有临床的小伙伴有样本样本的话是不是也可以在其他癌型上进行类似分析呢~