多区域测序分析肺腺癌的瘤内异质性

导语

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瘤内异质性（intratumor heterogeneity，ITH）是指同一恶性肿瘤在同一患者的不同肿瘤部位的细胞之间，在基因型和表型上存在差异。这种不一致性导致了恶性肿瘤在演变过程中的高度复杂性和多样性。ITH可能对肿瘤活检策略、可操作靶点的表征、治疗和耐药性产生影响。

背景介绍

随着NGS方法的使用，对几种癌症中的ITH进行的大量研究发现不同肿瘤中ITH是可变的。单次活检可能不足以从肿瘤中识别所有癌基因突变，它对潜在治疗靶点认识不完整。这篇文章是2014年发表在Science上，对11例局部肺腺癌样本进行了多区域全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES），均有明显的ITH。术后中位随访数据表明，亚克隆突变比例较大的患者术后复发的可能性大。

数据介绍

从11例手术治疗切除的肺腺癌样本中获得48个肿瘤区域：8个stage I,2个stage II,1个stage III；肿瘤大小2~4.6 cm（Fig.1和table S1）。

Fig.1

结果解析

1.WES检测突变

多区域WES方法（平均深度为277×）鉴定出7269个突变，其中7026个（97%）体细胞突变通过单独定制的捕获测序实验（平均深度为863×）进行验证。肿瘤之间的突变数量存在显著差异（Fig.S1），但突变负担与年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结状态或吸烟状态之间无显著相关性。

2.肿瘤突变树结构分析

研究ITH的一个有效方法是把一个肿瘤描绘成树状结构，主干代表所有区域普遍存在的突变，分支代表只存在于某些区域的异质突变，私有分支代表只存在于一个肿瘤区域的突变。突变在主干和分支上的位置反映了相对时间的变化。

将此方法应用于这11例肺腺癌的多区域测序数据。在每个研究的肿瘤中都发现了ITH的证据，不同肿瘤之间的树状结构差异很大（Fig.1）。在肿瘤区域突变树的背景下，14个已知的癌症基因点突变中有13个被定位到突变树的树干上（Fig. 1 and table S3），说明这些突变是在11个肿瘤的进化早期发生。表明单区域抽样可能足以识别局部肺腺癌中大多数已知的癌基因突变。

3.评估相对于ITH的拷贝数变化

大规模染色体畸变没有观察到实质性差异（Fig.S2A），同一肿瘤内不同区域的log2比值分布相似（Fig. S2B）。

通过分析11例肺腺癌已知癌基因的扩增或删除并将其映射到系统发育树上的相对位置上（Fig. 1），发现已知癌症基因的扩增和/或删除（与已知癌症基因点突变一样）也是这11个肿瘤的早期分子事件。

4.中位随访

术后中位随访21个月，3例患者病情复发。这3例患者原发肿瘤的亚克隆非主干突变（分支+私有分支突变）比例显著高于未复发患者（复发患者平均40%，未复发患者平均17%，t_test P = 0.006）（Fig.1）。提示亚克隆突变可能对癌症进展很重要，而亚克隆突变比例较大可能与这些肺腺癌患者术后复发的可能性大有关。

5.分析吸烟者的突变谱

分析11例肺腺癌的突变谱，在吸烟者和非吸烟者中观察到不同的突变谱。292、339、356和270、472、4990、283显示以C>T为主的突变谱，317、499、330显示C>A为主的突变谱，324的肿瘤中C>T（26%）与C>A（21%）的替换比例相当（Fig.3A）。这些结果表明，吸烟者的突变谱反映了吸烟接触量和戒烟时间。

Fig.3

6.分析肿瘤内突变的动态变化

另外在6个肿瘤中观察到突变谱的显著差异（Fig.3B和C），表明在这些肿瘤的发展过程中，可能在不同的时间发生了特定的突变。

有研究表明，APOBEC活性是C>T和C>G突变的主要来源。因此，我们要研究在这类肺腺癌中是否存在APOBEC突变过程。28%的突变具有特定的替代模式（TpCpW位点的C>T/G，W代表A/T），与APOBEC介导的过程一致 （Fig. S3）。有7病例的非主干突变比主干突变的APOBEC突变特征富集更明显，但只对病例330有统计学意义（Fig. 3D）。这些数据表明，在肺腺癌亚群中发现的突变中，有一种类似APOBEC的过程起了重要作用，而且这种过程在随后的亚克隆突变中更明显，强调了突变过程的动态本质。

7.ABSOLUTE算法评估ITH

我们观察到每个肿瘤区域的体细胞突变的等位基因频率都有很大的变化 （Fig. S4A）。使用ABSOLUTE算法评估每个肿瘤区域内的亚克隆部位异质性，至少29（共48）个肿瘤区域存在区域内亚克隆细胞群。在同一肿瘤的不同采样区域，部分患者的克隆和亚克隆突变分布存在差异 （Fig.S4B），这表明，单次活检分析不足以完全解释这些肿瘤中的ITH。

为了探讨这些数据对临床常规ITH评估的意义，我们对每个患者所有肿瘤区域的联合测序数据重复进行ABSOSOLUTE算法分析，在每个患者水平上评估全局ITH。与肿瘤突变树分析相似，3例复发患者的原发肿瘤亚克隆比例均较大（复发患者平均41%，未复发患者平均24%，t_test P = 0.045）（Fig.S5A）。对每个患者的合并数据使用互补的贝叶斯狄利克雷过程，结果显示相同的趋势（复发患者平均亚克隆突变66%，未复发患者平均亚克隆突变36%，t检验P = 0.035）（Fig. S5B）。这些结果表明，从预后的角度衡量整体亚克隆比例可能有意义。

小编总结

WES方法和深度测序方法检测突变。构建11个肿瘤的突变树，比较发现突变是在肿瘤的进化早期发生。癌症基因的扩增和/或删除也在肿瘤进化早期发生。另外增加测序深度能够更准确检测癌症基因突变，帮助研究肺腺癌的ITH。

术后中位随访研究发现肿瘤突变过程的动态本质，亚克隆突变比例较大的患者术后复发的可能性也大。

ABSOLUTE算法评估48个肿瘤区域内的亚克隆部位异质性，发现存在区域内亚克隆细胞群，且患者的克隆和亚克隆突变分布存在差异。

越来越多手术切除治疗肿瘤，有机会从切除肿瘤中获得的更多区域样本进行深度测序。需要最适当的分析处理算法在更大的患者群体中证实临床相关性，最好具有全面的临床注释和复发时的重复活检。

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