Day5 | 表观遗传组学研究：染色质5'转座酶可及性测序(ATAC-seq)

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通观2021年国自然基金项目指南，其中研究主题涉及基因表达调控的热点就有8个，其中表观遗传学、转录因子、以及组蛋白修饰等受到越来越多人的关注。

在上一讲中，我们讲解了DNA的启动子甲基化（主要发生在CpG岛上）的表观遗传学改变对基因转录的调控作用和研究方法。

我们知道，一般认为在顺式调控元件部位（包括启动子、增强子等部位）甲基化，将影响DNA的结构（核小体上的DNA双链无法打开），从而阻遏该部位基因的转录。

我们今天要讲的染色质5'转座酶可及性测序，直接用于观察全基因组染色质开放景观的特征，即发现关键基因启动子区域的染色质开放状态水平（只有染色质处于开放状态了，才能有可能和转录因子/Transcription factor等转录调控相关因子结合）。这是理解的重点！

启动子区域的染色质结构变化和开放性的改变是基因表达调控的重要机制，通过研究染色质开放景观，分析染色质的基因序列（即启动子序列），结合生物信息学算法可预测该序列可结合的转录调控因子，从而理解转录因子通过结合启动子、促进基因转录的分子机制。

常见的染色质可及性的检测技术

常见的染色质可及性的检测技术

染色质开放区4种研究方法的比较

（Epigenetics ＆ chromatin, 2014, 7(1): 33.）。

前面4 种技术虽然都能应用于染色质开放性的表观基因组学研究，但通病是通常需要几万至数百万个细胞作为输入材料用以平均细胞群体的异质性，涉及到复杂、耗时的样品制备过程，且不能同时探究核小体定位、染色质可接近性和转录因子结合的相互作用。而多数情况下，很多重要且稀少的细胞亚型可能很难提供足够的样品量进行全基因组染色质可及性分析。

2013 年，Buenrostro 等建立了材料需求量少、过程更为简便、效率更高的ATAC-seq 技术(assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing,ATAC-seq）。

该技术仅需两步就能从500~50,000 个细胞捕获染色质开放区域。与其他技术方法不同的是，ATAC-seq 利用高度活跃的Tn5 转座酶代替DNase I核酸酶、微球菌核酸酶MNase 等分析染色质易接近性，能够将目的DNA 片段化、末端修复和加上测序所需的接头(adaptor)一步完成，从而使建库步骤变得极为简便，达到投入量更低、通量更高的建库效果。

转座及扩增过程示意图

一分析结果呈现一

1：转录因子区域

结果解释：4种细胞（Jurkat、H1 ESC、GM12878、K562）的染色质的开放区域（图中红色）不同，根据各自的开放区域预测了能与之结合的转录因子（箭头所指）。如Jurkat细胞开放的染色质区域倾向于结合的转录因子有TCF7L2、ID4、RUNX2/3和LEF1。

2：基因的选择性表达

结果解释：(图A)不同 T 细胞亚群中Tox2基因座的全基因组组蛋白修饰，发现它在 Tfh 细胞中被活性染色质H3K4me3 标记，同时该位点没有被抑制性染色质H3K27me3标记；(图B)ATAC-seq 分析得出与幼稚 CD4+T细胞相比， Tox2基因座在Tfh中显示出染色质可及性增加（即染色质开放程度增大）；(图C)qRT-PCR测序：Tox2 mRNA 表达与Cxcr5、Bcl6和Pdcd1密切相关。

Accessibility. Immunity. 2019 Nov 19;51(5):826-839.e5.

3：细胞分化、发育

结果解释：Nfil3基因的染色质开放程度在脾脏TregKlrg1-Nfil3-中较低，在Nfil3+表达阳性的脾脏Treg较高。当脾脏Treg继续分化进入组织中变成tisTreg后，Nfil3基因的表达降低，特别是在脂肪组织和肺组织中。ChIP-seq:Batf很可能是Nfil3的启动转录因子。

进一步的探索三种不同Treg转录因子BATF的表达情况，也证实了上述观点：转录因子BATF促进了Nfil3基因的转录表达。

4：单细胞测序（scRNA-seq+scATAC-seq），即在同一个细胞中同时检测RNA表达水平和染色质的可及性

结果解释：通过一个简单的流程将同一个单细胞的RNA-seq和ATAC-seq的数据相整合，获得转录图谱和染色质景观的一体化视图。以单细胞核悬液作为起始样本，对大量细胞核进行转座酶切割，之后将单个细胞核捕获在GEM（Gel Bead-in-emulsion）中，其中DNA片段和mRNA的3端都带有条形码，每个样本生成两个互补文库（基因表达文库和ATAC文库），将基因表达和开放染色质图谱准确的链接回同一个细胞。

Science. 2020 Oct 2;370(6512):eabb8795.

一小结一

ATAC-seq应用广泛，常用的可以分为以下三点：

• 用于不同病理状态和疾病分组的患者组织细胞／血液细胞的染色质开放景观全景图谱的绘制，同时可与mRNA表达信息进行整合，并从中得到转录异常调控的信息；
• 单细胞ATAC组学研究可以从单细胞的角度分析特定细胞群（比如免疫细胞，间质细胞，肿瘤细胞等）表观遗传学信息的异质性；
• 用于研究人类细胞分化过程中，染色质开放景观改变，而导致的程序性的转录调控信息；

常用研究思路：