12分+纯生信=CAF+单细胞+肿瘤耐药，这个热点组合相当哇噻~

肿瘤微环境基质细胞中，肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)是最丰富的，并在癌症进展中起重要作用。目前基于特定细胞表面标记物对CAF的研究不仅加深了人们对其表型异质性和功能多样性的认识，而且也将靶向CAF治疗癌症提上了议程，使CAF成为肿瘤研究的又一热点。

癌症相关成纤维细胞 (cancer-associated fibroblasts, 简称 CAFs) 是 TME 中的主要基质细胞（占基质细胞50%以上），在癌症中扮演重要作用。

CAFs在癌症中扮演重要作用：

①分泌各种因子促进癌细胞生长、血管生成、上皮间质转化 (EMT)、ECM 重塑与癌细胞转移；

②募集免疫抑制细胞 (包括 MDSCs 和 TAMs) 来抑制细胞毒性 T 细胞 (CTLs) 的活性，导致免疫抑制与肿瘤逃逸；

③塑造肿瘤外基质、形成药物或治疗性免疫细胞渗透屏障，阻止药物与免疫细胞向肿瘤组织的深层渗透，从而降低肿瘤治疗效果；

③通过促进癌症干性 (stemness)、代谢调节和干扰免疫治疗效果来促进癌症复发和耐药性。

因此，通过调控 CAFs 或克服其屏障作用抑制肿瘤是肿瘤治疗的新手段。

【CAF亚型、耐药机制、抑制免疫机制等层面都是研究CAF非常好的切入点，大家不不妨试一试】

2022年至今，已经有多篇CAF相关文章出现，其中包括很多高分文章。今天给大家带来的是2021年5月发表在期刊CAF+单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) +肿瘤免疫治疗耐药性的一篇文章，可谓全是热点傍身呀~

Clin Cancer Res. 2021 May 1;27(9):2636-2647.

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研究背景和设计

癌症相关成纤维细胞 (CAF) 可以支持或抑制肿瘤生长。然而，区分促进肿瘤和抑制肿瘤的 CAF 的标记基因和分子机制尚不清楚。此外，尚不完全了解肿瘤起源组织如何影响不同肿瘤微环境中 CAF 的功能。

作者以单细胞分辨率识别并描述了黑色素瘤 (MEL)、头颈部鳞状细胞癌 (HNSC) 和肺癌 (LC) 中六种 CAF 亚型的分子特征，确定在CAF 亚型中激活的关键分子途径。

进一步使用癌症基因组图谱 (TCGA) 资源，证明这些 CAF 亚型与不同癌症类型的不良或良好临床结果密切相关。

重要的是，作者还研究了将这些 CAF 亚型与肿瘤进展和免疫治疗耐药联系起来的潜在分子机制。

图1.研究设计和研究方法示意图

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材料和方法

1.数据来源

• GEO数据库: GSE72056和GSE103322，包含来自MEL 和HNSC的CAF 的单细胞 RNA-seq 数据；
• LC的数据集来自https:// doi.org/10.1038/s41591-018-0096-5；
• TCGA数据库: 31种癌症类型的10000多个RNA-seq数据集用于生存分析、基因富集分析等；
• 耐药数据集：对anti-PD-L1 免疫疗法有抗性的转移性膀胱和肾转移性肿瘤转录组数据 ( http://research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies ) 和对anti-PD-1 免疫疗法有抗性的黑色素瘤的转录组数据（GSE78220）

2.CAF scRNA-seq 分析

3.pan-CAF亚型空间分布分析

4.转录因子（TF）分析

5.生存分析、GSEA富集分析

6.所有 scRNA-seq 和 bulk RNA-seq 数据均来自以前的出版物或公共领域。分析代码可在https://github.com/bioinfoDZ/panCAF获得。

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主要试验结果

1. Pan-CAF亚型的鉴定和分子表征

作者首先整合了三种癌症类型的 CAF ，高分辨率聚类确定了Pan-CAF 1-7这7个 CAF 亚型，这些泛CAF亚型存在于三种癌症类型中，但各丰度不同。然后进一步分析 pan-CAF 的表型和功能异质性，结果表明pan-CAF 亚型之间具有相似性和差异，以及每种 CAF 亚型可能产生的相关细胞因子和免疫因子，用于介导其与其他 TME 或肿瘤细胞的特定相互作用。最后，作者为pan-CAF 亚型的实验鉴定和分离提供一个框架，使用细胞表面蛋白质图谱数据库鉴定了在细胞膜表面产生蛋白质的标记基因。

图2.pan-CAF 亚型的标记基因和生物学过程。

A， UMAP（左）描绘亚型和热图（右）描绘与泛 CAF 亚型相关的标记基因。pan-myCAF，肌成纤维细胞样 CAF；pan-dCAF，促纤维化 CAF；pan-iCAF 和 pan-iCAF-2，炎症样 CAF；pan-nCAF，正常肌成纤维细胞；pan-pCAF，增殖的 CAF。B，个别癌症类型中 CAF 亚型的比例。

C，显示泛 CAF 亚型的标记基因表达的点图。

D，泛 CAF 亚型的丰富基因集。

E， UMAP 描绘了泛 CAF 亚型的细胞周期状态。

F，与选定功能相关的基因表达热图。

G，编码细胞表面蛋白的基因表达的热图。

2.瘤内和瘤间CAF异质性

为了解决泛 CAF 在肿瘤中的空间分布这个问题，作者使用 CIBERSORTx 和整合的 pan-CAF scRNA-seq 数据，发现通常估计的 pan-CAF 丰度显示肿瘤/患者之间存在很大差异，但从同一肿瘤的不同区域采集的样本差异相对较小。

S2. Robustness of pan-CAF clustering

3.CAF 亚型特异性 TF 和基因调控网络

为了更好地了解Pan-CAF 亚型是如何在遗传上建立和维持的，作者应用软件 SCENIC 来识别各CAF亚型中高度活跃的 TF 及其靶基因。

图3.与泛 CAF 亚型相关的 TF 和调控基因程序。

A， TFs基因表达的热图。

B，描绘MEF2C表达的小提琴图（顶部）和描绘myCAF 中上调的 MEF2C 靶基因的热图。

C，描绘TWIST1表达的小提琴图（上）和描绘 dCAF 中上调的 TWIST1 靶基因的热图。

D，描绘NR1H3表达的小提琴图（上）和描绘 iCAF 中上调的 NR1H3 靶基因的热图。

E，描绘RELB表达的小提琴图（上）和描绘在 pan-iCAF-2 中上调的 RELB 靶基因的热图。

F，描绘FOXM1表达的小提琴图（上）和描绘 FOXM1 靶基因在 pan-pCAF 中上调的热图。

4.Pan-CAF亚型特异性基因signature的预后效用的泛癌评估

先前的研究表明，CAF 可以在 TME 中发挥抗肿瘤作用，并可能导致不同癌症类型的疾病恶化。作者想知道这是否与在各种癌症中存在不同的 CAF 亚型有关。因此，作者进一步评估了癌症类型和起源组织如何塑造肿瘤的 CAF 格局以及已确定的泛 CAF 亚型的促肿瘤和抗肿瘤特性。

为了解决这个问题，作者策划了Pan-CAF 亚型特异性基因signature，并使用它们来评估TCGA 中获得的 31 种癌症类型的Pan-CAF 丰度，并以特征基因的更高表达代表Pan-CAF 亚型的高丰度，以此特征评估Pan-CAF 亚型的预后效用。为了更好地评估我们策划的泛 CAF 亚型基因特征的预后效用，作者在调整年龄和性别的同时进行了多变量 cox 比例风险建模。结果支持CAF亚型特异性特征基因的高表达与上述每种癌症类型的临床结果显着相关。

最后，研究结果表明了癌症类型和起源组织是如何塑造 CAF 亚型的，并提供洞察哪些pan-CAF 亚型可能有助于特定癌症类型的肿瘤促进或肿瘤抑制作用。

图4.与不同癌症类型的临床结果相关的特定泛 CAF 亚型。

Kaplan-Meier 图描绘了 BLCA ( A ) 中高和低 pan-myCAF、KIRC ( B ) 和 STAD ( C ) 中的 pan-dCAF、LGG ( D ) 中的 pan-iCAF 和 pan-iCAF患者之间的生存差异SKCM ( E ) 中的 -2，MESO ( F )中的 pan-pCAF 。

G，六个泛 CAF 基因特征的 HR 对肿瘤类型的聚类。点图，其中大小与统计显着性相关，颜色表示 HR [红色 = HR 高于 1（预后不良），蓝色 = HR 低于 1（预后良好）]。*, FDR < 0.05; **，FDR < 0.01。

5.Pan-CAF亚型与肿瘤中特定分子功能的关联分析

由于到单个Pan-CAF 亚型与特定癌症类型的不良预后相关，因此作者试图确定在Pan-CAF 亚型丰度更高的肿瘤中失调的分子途径。对于 CAF 亚型与不良或良好预后显着相关的癌症类型，应用了ranked GSEA。

结果表明，不同的pan-CAF 亚型存在TME 中，它们可能提供有利或不利的环境，通过激活或抑制特定基因通路来促进或阻碍各种癌症类型的肿瘤发展。这一假设需要通过以后的功能分析来验证。

图5.REACTOME 术语网络在不同CAF 特征基因高表达的肿瘤中富集或缺失。节点是在肿瘤中表达较高的基因中富集（红色圆圈）或耗尽（蓝色圆圈）的术语，CAF 基因特征的表达增加，而边缘将术语与重叠基因联系起来。具有相似功能的连接节点通过使用富集图的更通用术语进一步总结。在每个节点中，填充颜色代表来自各个癌症类型的结果。

A，来自 BLCA 和 KIRP 癌症的 pan-myCAF 结果。

B， KIRC、KIRP、LGG、UVM、MESO 和 STAD 癌症的 pan-dCAF 结果。C， LGG 的泛 iCAF 结果。

D， LGG 和 SKCM 癌症的 pan-iCAF 2 结果。

E，用于 KIRC、KIRP、LGG 和 MESO 的泛 pCAF。

6.Pan-CAF亚型与抗 PD1 / PD-L1 免疫治疗耐药的关联分析

转移性尿路上皮癌和转移性黑色素瘤的靶向PD-L1 或PD-1免疫治疗效果佳且持久。观察到特定的 pan-CAF 亚型表达免疫抑制炎症因子（如CXCL12、CXCL14），因此作者进一步利用抗PD-L1治疗的转移性尿路上皮肿瘤和用抗PD-1处理的转移性黑素瘤的公共数据集研究了 pan-CAF 亚型是否与免疫靶向治疗的有效性相关。

结果发现，在接受抗 PD1 / PD-L1 免疫治疗出现 PD 的转移性膀胱癌、转移性黑色素瘤、转移性肾癌患者中观察到与 pan-CAF 相关的基因集的阳性和显着富集。这些结果表明，特定的pan-CAF 可能与转移性膀胱癌、黑色素瘤和肾癌中的 ICB 耐药相关。

( A ) 用抗 PD1 治疗的膀胱肿瘤的基因集富集分析显示 pan-myCAF（左上）、pan-dCAF（右上）和 pan-iCAF（左下）和 pan-与完全缓解 (CR) 和部分缓解 (PR) 患者相比，进展性疾病 (PD) 患者的 pCAF（右下）基因特征。

( B ) 用抗 PD1 治疗治疗的转移性黑色素瘤的基因集富集分析显示 pan-myCAF（左上）、pan-dCAF（右上）、pan-iCAF（左中）、pan-与 CR 和 PR 患者相比，PD 患者的 pCAF（中右）和 pan-iCAF-2（左下）基因特征。

( C) 与 CR 和 PR 患者相比，用抗 PD1 治疗治疗肾肿瘤的 GSEA 显示 PD 患者的 pan-dCAF 基因特征显着富集。每个面板中的热图显示了 PD 和 CR/PR 肿瘤之间前沿基因的表达差异。

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小结

该研究确定了在癌症类型中常见的六种 CAF 亚型的遗传特征。使用 TCGA 数据库研究了各个 CAF 亚型的临床相关性，并将CAF 亚型与潜在的基因表达程序联系起来（也是文章的亮点所在），这些基因表达程序可以在肿瘤生物学、临床结果和 ICB 耐药性中发挥关键作用。