单细胞转录分析揭示纤维化过敏性肺炎的细胞异质性
前言
题目：Characterizing cellular heterogeneity in fibrotic hypersensitivity pneumonitis by single-cell transcriptional analysis 日期：2022-01-28 期刊：Cell Death Discovery 链接：https://www.nature.com/articles/s41420-022-00831-x
摘要
过敏性肺炎(Hypersensitivity pneumonitis, HP)是易感和致敏个体吸入多种抗原引起的肺泡炎症或间质纤维化的复杂综合征，可以分为纤维化和非纤维化 HP。纤维化过敏性肺炎（FHP） 是一种致命的间质性肺病，但与特发性肺纤维化（ IPF） 相比，它仍然未被充分研究和了解。基因组指导的治疗仍然无法用于恶化的FHP 患者，这些患者的临床预后极差。毫无疑问，迫切需要表征FHP 的核心分子特征，以发现新兴的生物标志物和治疗靶点。
本研究整合来自 FHP 患者的外科肺活检标本的表达谱和已发表的研究数据库，包括GEO的大量RNA-seq 和 scRNA-seq，确定了FHP 相关的细胞亚群。文章还通过对来自已发表研究的 82 个慢性过敏性肺炎 (CHP) 肺样本的表达谱进行综合分析，揭示了特定细胞亚群的动态变化，并确定了 FHP 中的许多marker基因。
肺细胞的单细胞转录谱
作者通过外科肺活检从一名病理证实为 FHP 的患者收集了新鲜标本，另外整合了来自 GEO 数据库的多个数据，包括一名 FHP 患者 (GSM3489192) (P1) 和两名移植供体 (GSM3489182, GSM3489185) (C1, C2) 与医院患者的测序数据 (P2) 。总共 17,755 个肺细胞，其中 8761 个细胞来自供体，8994 个细胞来自 FHP 患者。
聚类分群得到29个clusters，注释了10个细胞类型：
- 上皮细胞（表达 SFTPA1）、
- 巨噬细胞（表达 C1QB、C1QA 和 C1QC）、
- 内皮细胞（表达 VWF 和 CLDN5）、
- 树突状细胞 (DC)（表达 LILRA4 和 GZMB）、
- 成纤维细胞（表达 COL1A1 和 COL1A2）、
- T细胞（表达 CD3E 和 IL7R）、
- B 细胞（表达 IGHG3 和 IGLC2）、
- 自然杀伤（NK）细胞（表达 GNLY 和 NKG7）、
- 肥大细胞（表达 MS4A2）
- 单核细胞（表达 S100A8 和 FCN1）。
与供体相比，FHP 患者的成纤维细胞、T 细胞和 NK 细胞数量增加。
使用 AUCell 对炎症反应和免疫相关特征进行富集分析，发现巨噬细胞和单核细胞中的炎症反应特征比较丰富，成纤维细胞表现出上皮间质转化 (EMT) 特征，NK 细胞和 T 细胞显示出更多的促炎症特征。另外发现 FHP 在炎症促进、EMT 和细胞因子/趋化因子方面的富集高于正常对照。因此，FHP 表现出更高的炎症反应、炎症促进和 EMT 特征。
FHP 疾病特异性巨噬细胞亚群
巨噬细胞在肺纤维化的发展中起着至关重要的作用，为了区分 FHP 中过多的巨噬细胞亚群，将巨噬细胞分为十个亚群（cluster 0-9）。作者进一步分析了这些亚群在 FHP 和正常肺中的差异，发现cluster4、5、6、7 和 9 是 FHP 受试者中占比较高的巨噬细胞亚群，而c 0、1、2 和 3 是正常肺中的主要巨噬细胞亚群。
之后确定了 FHP 中三种主要的巨噬细胞亚型：
- high PLA2G7（表达 PLA2G7）、
- high FN1（表达 FN1）
- high MS4A6A 巨噬细胞（表达 MS4A6A）。
作者用 CD68、PLA2G7 和 MS4A6A 抗体对组织进行了多重免疫荧光染色（图D）。结果显示high PLA2G7和high MS4A6A巨噬细胞的浸润存在于FHP的肺中，表明趋化功能在纤维化过敏性肺炎发展中的重要性。接下来发现 high PLA2G7 和 high MS4A6A 巨噬细胞中的炎症反应特征更丰富（图E）。
巨噬细胞被定义为经典激活的 M1 和交替激活的 M2 表型，具体取决于表面蛋白标记。作者使用 AUCell 评估了 M1 和 M2 特征基因集的富集情况。发现high FN1、 high PLA2G7和 high MS4A6A巨噬细胞显示出比其他巨噬细胞会富集更多的 M2 和 M1 基因（图GH）。
之后在 FHP组中使用 Monocle 2 研究巨噬细胞亚群的发育轨迹。在 FHP 的后期发育时间点发现了high PLA2G7和 high MS4A6A巨噬细胞。
FHP 患者肺泡上皮细胞的异质性
肺泡再生在人类肺纤维化中起重要作用，确定了13个clusters，注释了：
- alveolar type 1 (AT1) cells (expressing AGER and KRT7)
- alveolar type 2 (AT2) cells (expressing SFTPA1 and SFTPA2)
- club cells (expressing SCGB3A2 and SCGB1A1)
- ciliated cells (expressingTPPP3 and CAPS).
还定义了KRT17高表达的KRT 17 high basal-like 细胞亚群 (KRT 17高基底样细胞 )，FHP 患者表现出 KRT17高基底样细胞比例增加。
使用 AUCell评估了细胞类型特征基因集的富集，发现 KRT17高基底样细胞中肺基底细胞基因集和 EMT 基因集的富集程度更高。通过多重免疫荧光染色，在 FHP 肺的纤维化区域中进一步验证了 KRT17高基底样上皮细胞的存在。
之后使用 Monocle 2 和 Velocyto R 包研究 KRT17高基底样细胞的发育轨迹，在 FHP 的后期发育时间点发现了KRT17高基底样细胞和 AT1 细胞。AT2 细胞和club细胞与早期时间点相关联。
RNA 速率分析表明，KRT17高基底样细胞和 AT1 细胞比其他细胞具有更高的转录活性；使用 SCENIC 和 GSVA 分析，还发现 SOX4_extended motif在 KRT17高基底样细胞的转录调节中起关键作用。以上结果表明，KRT17高基底样上皮细胞是决定 FHP 中 EMT 预后的关键因素。
FHP 过程中成纤维细胞的异质性
肺纤维化的特点是肺成纤维细胞分化为肌成纤维细胞和过度的细胞外基质积累。这里得到4个cluster：
- cluster 0 被鉴定为 PLA2G2A高成纤维细胞（表达 PLA2G2A、APOD 和 C3）
- 基于 COL1A1 基因的高表达，cluster 1 被鉴定为 COL1A1高成纤维细胞。
- 基于 TCF21 的高表达，cluster 2 被鉴定为间质成纤维细胞（TCF21高成纤维细胞）。
- cluster 3 被鉴定为肌成纤维细胞（ACTA2高成纤维细胞）高表达 ACTA2 和 MYH11
AUCell发现，COL1A1高成纤维细胞表现出更强的EMT活性。TCF21高成纤维细胞的脂肪生成和糖酵解活性显著高于其他细胞类型。PLA2G2A高成纤维细胞表现出更高的血管生成活性和炎症反应特征。
另外，通过多重免疫荧光染色，在 FHP 肺的纤维化区域中进一步验证了 ACTA2高和 TCF21高成纤维细胞的存在。
之后同样看发育轨迹，在 FHP 的后期发育时间点发现了ACTA2高成纤维细胞和PLA2G2A高成纤维细胞。COL1A1高成纤维细胞与早期时间点相关。TCF21高成纤维细胞集中在 FHP 的中间发育时间点。
FHP细胞通讯分析
使用 NicheNet R 包 ( https://github.com/saeyslab/nichenetr )来预测细胞之间的配体-靶标联系。上皮细胞和成纤维细胞是肺纤维化期间的主要效应细胞，包括 IPF 和 FHP 。这里将上皮细胞或成纤维细胞指定为“受体”。
图A显示了可能调节上皮细胞的前 20 个配体，发现成纤维细胞中 COL1A1、NID1、CYR61、ANGPTL1 和 CFH 的表达水平增加对基底样细胞高表达KRT8 具有调节能力。还发现巨噬细胞中 CAMP、PLAU、PSAP、ALOX5AP 和 SPP1 的高表达显示出对成纤维细胞的调节能力。
巨噬细胞中增加的 SPP1 和 PLAU 显示出对 COL1A2 和 COL3A1 更高的调节能力。
