单细胞转录组测序揭示了离子化辐射下的细胞异质性

前言

题目：A heterogeneous cellular response to ionizing radiation revealed by single cell transcriptome sequencing 日期：2021-02-01 期刊：Am J Cancer Res. 链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7868766/

摘要

放射治疗是恶性肿瘤最有效的治疗方法之一。通过诱导 DNA 双链断裂，电离辐射 (IR) 利用具有包含 DNA 损伤修复系统的肿瘤细胞来控制肿瘤生长。组织病理学特征（如分化、增殖和组织特异性病理学）和肿瘤微环境因素（如缺氧和炎症）通常决定了对辐射的敏感性。此外，内在细胞辐射敏感性由遗传因素决定。

文章借助Smart-seq2 技术，使用乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 分析了 334 个单细胞的 3'mRNA 文库，确定了以独特方式响应 IR 的细胞群。此外还研究了共济失调毛细血管扩张症突变 (ATM) 激酶在 DDR 诱导的 DDR 中发挥关键作用，在 DDR 期间的细胞组成变化中的作用，并且选择了重要的 IR 诱导基因（MCM3、MCM4 和 SLBP）在 MDA-MB-231 和另外的乳腺癌细胞系 BT-483 中进行了验证。

基于单细胞测序的 IR 诱导的转录组变化

在Smart-seq2文库中，Ctrl 和 IR 组中的 88 和 93 个单细胞通过了质量控制，在 Ctrl 组和 IR 组的单个细胞中，平均分别检测到 6,937 和 6,488 个基因，以及 381,112 和 272,438 个 UMI。

检测了两组之间的差异基因，与 Ctrl 相比，IR 组共检测到142 个显著的 DEG，包含有 71 个上调基因和 71 个下调基因。然后进行富集分析，发现：上调基因主要与 G1/S 期和核糖体相关（比如有丝分裂细胞周期的 G1/S 过渡、核糖体组装），下调基因与抗生素代谢相关。STRING 网络分析也与GO结果类似。

IR影响下的细胞异质性

进行了 t-SNE 聚类分析，来揭示 Ctrl 和 IR 组的亚群组成。cluster 3 中的大多数细胞属于 IR 组（92.9%），这意味着c3 可能是 IR 处理后出现的新细胞亚群。

热图显示了每个cluster中top20上调基因，发现Cluster 1和Cluster 2的marker主要富集在与抗生素代谢相关的通路。分析了与核糖体相关的基因的平均表达，发现与两组中的其他簇相比，cluster 4的表达水平最高。

对于Cluster 3，作者进行了细胞周期分析，发现大部分细胞属于G1或S期（96.4%）。考虑到cluster 3 可能代表了上述 IR 后出现的新细胞亚群，那么它应该是经历了由 IR 诱导的 G1/S 期停滞。

在基因表达水平上，Cluster 1 和 Cluster 2 与 Cluster 3 相似，说明Cluster 3 中的细胞可能来自Cluster 1 和Cluster 2 中的 Ctrl 细胞。进一步的细胞周期分析表明，在Cluster 1 中，IR 影响下来自 G2/M 期的细胞比例显著下降（从 23.8% 降至 0%） ，但在Cluster 2 中不那么显著（从 65.4% 到 55%），这表明Cluster 3 中的多数细胞更可能来自Cluster 1。

值得注意的是，与Cluster 3 不同，其他Clusters同时混合了 Ctrl 和 IR 细胞。通过比较每个cluster中 Ctrl 和 IR 细胞的基因表达，我们发现所有三个cluster（1、2 和 4）都高表达核糖体相关的基因。

ATM knockdown严重削弱了 IR 后的基因表达

目前ATM（共济失调毛细血管扩张症突变） 是否以及如何在转录组水平影响异质细胞对 IR 的反应仍然未知。为了进一步了解它，作者将 MDA-MB-231 细胞（ATM-KD 组）中的 ATM 基因进行了knock down处理，得到ATM-KD和ATM-KD-IR（经IR处理的ATM敲低细胞）组，质控后分别有73和80个单细胞。在 ATM-KD 和 ATM-KD-IR 组的单个细胞中分别检测到 6,124 和 6,904 个基因，以及 389,100 和 392,388 个 UMI。

为了说明 ATM 敲低如何影响基因表达，作者比较了 ATM-KD 和 Ctrl 组。与 Ctrl 相比，ATM-KD 组共检测到410 个显著的 DEG，其中包括 162 个上调基因和 248 个下调基因。上调基因与核糖体相关，下调与抗生素代谢相关。因此ATM 敲低可能导致核糖体相关基因的上调和抗生素代谢相关基因的下调。

为了找出 ATM KD如何影响细胞对 IR 的反应，作者通过使用组合数据分析了 ATM-KD-IR 和 ATM-KD 组之间的 DEG，并将它们与 IR 和 Ctrl 组之间的 DEG 进行了比较。

与野生型细胞相比，ATM KD细胞中的 DEGs 和显著 DEGs 的数量要少得多。在 ATM KD细胞中，数量为 214（包括 ATM-KD-IR 组中的 55 个上调基因和 159 个下调基因），而在野生型细胞中，数量为 337 （包括IR组168个上调基因和169个下调基因）。在 ATM KD细胞中，共有 29 个显著的 DEG（包括 ATM-KD-IR 组中的 12 个上调基因和 17 个下调基因），而在野生型细胞中共检测到 84 个显著的 DEG（包括 IR 组中的 38 个上调基因和 46 个下调基因），意味着 ATM KD严重削弱了 IR 诱导的基因表达。

ATM KD 影响单细胞水平的异质性

对 ATM-KD 和 ATM-KD-IR 组进行了 t-SNE 聚类分析，发现了3个细胞群。发现 Cluster 2 的marker在与 M 期相关的 GO 通路富集（包括有丝分裂姐妹染色单体分离、有丝分裂纺锤体组织、有丝分裂核分裂等）。

对来自每个cluster的细胞进行了细胞周期分析，发现 ATM KD细胞和野生型细胞之间的差异。在野生型细胞中，Cluster 3 中的几乎所有细胞都经历了 IR 处理。这种现象表明ATM KD本身可能在一定程度上引起G1/S期阻滞。并且在 ATM KD细胞中，少数细胞也可能在 IR 后经历 G1/S 期阻滞，类型归为Cluster 3，但数量远低于野生型细胞。

还注意到 ATM KD细胞中的Cluster 1 都属于 G1 或 S 期。这表明在 ATM KD细胞中，Cluster 3 只能来自 Cluster 2 中未经 IR 处理的细胞。与野生型细胞不同，Cluster 3 的大多数细胞更可能来自 Cluster 1，这表明 G1/S 期抑制响应 IR 的Cluster 1 可能取决于 ATM 基因的表达。