单细胞 RNA 测序揭示瘢痕疙瘩中成纤维细胞和血管内皮细胞的谱系特异性调节变化

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题目：Single-Cell RNA-Sequencing Reveals Lineage-Specific Regulatory Changes of Fibroblasts and Vascular Endothelial Cells in Keloids 日期：2021-07-06 期刊：J Invest Dermatol 链接：https://www.jidonline.org/article/S0022-202X(21)01417-2/fulltext

摘要

瘢痕疙瘩是一种皮肤纤维化疾病，由异常的伤口愈合反应引起。尽管瘢痕疙瘩被归类为良性真皮生长，但它们表现出与恶性肿瘤相似的生物学特征，例如过度增殖、抗凋亡和侵袭。瘢痕疙瘩仍然是一个治疗挑战，缺乏药物治疗，部分原因是对发病机制的了解不完整。对来自瘢痕疙瘩皮肤组织和邻近的相对正常组织的 28,064 个细胞进行了单细胞 RNA 测序，观察到瘢痕疙瘩中成纤维细胞和血管内皮细胞亚群的显著扩增，反映了它们与瘢痕疙瘩发病机制的密切关联。结果强调了 TGFβ 和 Eph-ephrin 信号通路在瘢痕疙瘩异常纤维化和血管生成中的作用，发现了可能参与瘢痕疙瘩成纤维细胞纤维形成的关键调节因子，例如鉴定了 TWIST1、FOXO3和SMAD3。

单细胞 RNA-seq 揭示瘢痕疙瘩皮肤组织的细胞多样性和异质性

使用了来自四名患者的瘢痕疙瘩病变皮肤组织（即 CASE）和与瘢痕疙瘩瘢痕相邻的正常组织（即 CTRL），获得了 28,064 个细胞（CASE：12,425；CTRL：15,639），分成了21 个cluster。

• 角质形成细胞谱系（标记为KRT5和KRT14 )占细胞的最大比例（41.7%）
• VECs （由PECAM1和CDH5标记）占细胞的第二大比例（26.3%）
• 淋巴内皮细胞 (c16) 在谱系特异性标志物如LYVE1和PROX1的表达上与 VEC 不同
• 成纤维细胞谱系（由PDGFRA和DCN标记）包括两个集群 c3 和 c9
• 还发现了其他典型的皮肤谱系，包括汗腺细胞（由AQP5和MUCL1标记）、平滑肌细胞 (标记为MYH11和CNN1 ) 、壁细胞 (用PDGFRB和RGS5标记)、神经细胞 (由NRXN1和SCN7A标记)、黑素细胞（由MLANA和DCT标记）、

瘢痕疙瘩中成纤维细胞和 VEC 亚群的比例变化

细胞密度和分布的可视化揭示了多个细胞谱系的相对比例发生了巨大变化

• 在瘢痕疙瘩中观察到 VEC 和成纤维细胞的谱系扩张
• 在角质形成细胞和白细胞中观察到收缩

在 CASE 中，三个 VEC 集群 c4、c5 和 c18 显著扩展。值得注意的是，一个成纤维细胞簇 c9 也显著扩大

与正常皮肤组织相比，瘢痕疙瘩中的成纤维细胞和 VEC 亚群显著扩大，反映了它们与瘢痕疙瘩发病机制的密切关联

基因集富集分析揭示了瘢痕疙瘩成纤维细胞中失调的通路

其中a图是REACTOME 通路的网络视图。点的大小反映了基因集的大小。红色的点表示上调的途径，蓝色的点表示下调的途径。ECM(excessive extracellular matrix)-相关的通路，比如ECM 组织和胶原形成等通路明显上调

值得注意的是，几个信号通路在瘢痕疙瘩成纤维细胞中被激活。TGFβ 和经典 WNT 信号通路在瘢痕疙瘩或其他纤维化疾病中的作用已得到充分证实。另外发现一组参与PTEN基因转录负调控的基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中上调，这与瘢痕疙瘩成纤维细胞过度增殖和抗凋亡等恶性特征一致。

最近被认为与心脏纤维化相关的 Eph-ephrin 信号通路，在瘢痕疙瘩成纤维细胞中被显著激活。编码 Eph-ephrin 信号转导的配体和受体的多个基因，例如EFNB1、EFNB2、EPHB2、EPHB3和EPHA3在瘢痕疙瘩成纤维细胞中上调。

瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞异质性

图AB：成纤维细胞簇 c3 和 c9 显示出不同的特性：与c3相比，c9表现出更明显的肌成纤维细胞表型：观察到收缩基因（例如，ACTA2、TAGLN和MYL9）、胶原蛋白和弹性蛋白基因（例如，COL1A2、COL3A1和ELN）以及肌成纤维细胞标志物（例如，FN1和CTHRC1）的显著更高的表达

之后又继续细分五个亚群：

• 最接近 s0 的亚群是 s4，发现它们富含 ECM term，因此代表了两个肌成纤维细胞亚群。然而，它们在 ECM 的成分上有所不同：s0 表现出更高水平的胶原蛋白，而 s4 表现出更高水平的弹性蛋白
• s1 的特征基与免疫反应相关，例如补体激活和淋巴细胞趋化性的调节
• s2 的特征基因与白细胞趋化性、碳水化合物代谢和应激反应相关
• s3 的特征基因与应激反应和分化相关

成纤维细胞的拟时序分析

使用 Monocle2 对所有成纤维细胞进行了拟时序分析，揭示了具有两个主要分支的分支轨迹，即细胞命运 1 和细胞命运 2。

• 亚群s0和s4构成了细胞命运1分支的大部分，因此代表了肌成纤维细胞表型的细胞状态
• 亚群 s1 和 s3 构成了细胞命运 2 分支的大部分，因此代表了与免疫反应、应激反应和分化相关的细胞的特殊状态
• 亚群 s2 占前支的最大比例，代表成纤维细胞的初始状态

图e 显示了来自正常和瘢痕疙瘩皮肤组织的成纤维细胞构建的调节网络，在 TF 基因中，TWIST1根据程度中心性排名最高，表明该调节因子在瘢痕疙瘩发病机制中的关键作用；EPHB2在信号受体基因中名列前茅，即 Eph-ephrin 信号通路可能在瘢痕疙瘩发病机制中起关键作用。

最终确定了九个 TF，包括TWIST1、YBX3、NFIL3、JARID2、NCOA7、FOXO3、NFKBIA、ETS2和SMAD3 ，在这些 TF 中，SMAD3是已知的瘢痕疙瘩调节剂，TGFβ 信号通过它发挥其促纤维化作用。TWIST1和FOXO3与纤维化和器官纤维化有关。