iTOL：给系统发育树添枝加叶开花！
iTOL（https://itol.embl.de/）也即Interaction Tree Of Life，是一个集系统发育树在线展示、注释与管理为一体的交互工具。绘图过程中可以随意调整树枝、标签的颜色、形状和字体。iTOL最大的特点是可以同时展示不同的数据集，按照个性化的需求控制数据集的位置、大小和颜色，并允许导出高质量的位图和矢量图。
iTOL的输入文件主要包含两个部分：原始系统发育树文件（能识别Newick、Nexus、PhyloXML、Text和Jplace等格式）以及系统发育树注释文件。原始系统发育树文件根据DNA序列或者蛋白序列通过建树工具获得，注释文件模板可以从官网下载（https://itol.embl.de/help/templates.zip），如下所示：
下载解压后内容如下所示：
不同的模板用于不同的注释方式，适合不同的数据类型，根据模板名字我们大致可以看出其注释方式，例如箱线图（boxplot）、热图（heatmap）、饼形图（piechart）、物种分布特征图（binary）、堆叠柱状图（multibar）、颜色分类（color_strip）物种相关性（connections）等
接下来，我逐步介绍原始系统发育树文件的导入与美化，以及注释文件的编辑配置。首先，在iTOL主页上方点击Upload，点击“选择文件”按钮选择系统发育树文件，然后点击下方“Upload”按钮开始上传，Tree name填写或者不填都可以，如下所示：
数据上传后，网页会跳转至进化树绘制面板界面，如下所示：
通过调整控制面板（Controls）中的参数可对进化树进行简单编辑，如调整树的性状（Display mode）、物种字体（Label font）、标签对齐（Label alignment）、标签旋转（Label rotation）、树枝粗细及颜色（Branch lines），甚至任意旋转进化树的方向（Parameters）等。Advanced栏下还有更多编辑条目，例如是否显示Bootstrap值等，如下所示：
整棵树均为可编辑状态，用鼠标点击相应的节点或标签就可以出现编辑条目，如下所示：
可编辑的内容包括颜色（包括节点颜色与分支颜色）、分支线条类型、标签内容及格式（默认标签内容为节点名称，节点名称也即建树时序列的名字）以及Tree structure，Tree structure包括重定根（根据outgroup物种或者参考文献确定root位置）、折叠分支（不重要的分支可以合并展示）。
接下来我们着重阐述注释信息的添加。首先我们以修改标签内容的模板labels_template.txt为例，空白未修改的模板如下所示：
模板文件我们推荐使用软件Notepad++打开并编辑。
模板最前面写明了其用途（use this template to change the leaf labels），下面为模板的设置，每一个设置条目也都有详细的英文说明。强制设置的条目（MANDATORY SETTINGS）里面有分隔符的设置，可以选择制表符tab、空格、逗号，绝大多数情况下我们倾向于选择制表符，那样Excel中的数据可以直接复制粘贴到里面。你选择哪一种分隔符，就把该条目前面的“#”去掉，且保证另外两项前面都要有“#”。下面即为数据添加位置，模板中给出了示例，我们可以在Excel中编辑并直接粘贴到Notepad++中，编辑好之后如下所示：
现在返回浏览器的iTOL页面，在右下角有一个“+”按钮，点击就可以上传刚才编辑好的注释文档，如下所示：
树的修改效果如下所示：
可以看到标签内容已被修改，但是节点名字仍是不变的，接下来添加各种内容仍需基于原来的节点名字。接下来，我们可以添加物种的属性标记，使用dataset_symbols_template.txt模板，如下所示：
DATASET_SYMBOL
#Symbol datasets allow the display of various symbols on the branches of the tree. For each node, one or more symbols can be defined.
#Each symbol's color, size and position along the branch can be specified.
#lines starting with a hash are comments and ignored during parsing
#=================================================================#
# MANDATORY SETTINGS #
#=================================================================#
#select the separator which is used to delimit the data below (TAB,SPACE or COMMA).This separator must be used throughout this file (except in the SEPARATOR line, which uses space).
SEPARATOR TAB
#SEPARATOR SPACE
#SEPARATOR COMMA
#label is used in the legend table (can be changed later)
DATASET_LABEL Property
#dataset color (can be changed later)
COLOR #104E8B
#=================================================================#
# OPTIONAL SETTINGS #
#=================================================================#
#each dataset can have a legend, which is defined below
#for each row in the legend, there should be one shape, color and label
#shape should be a number between 1 and 6:
#1: square
#2: circle
#3: star
#4: right pointing triangle
#5: left pointing triangle
#6: checkmark
LEGEND_TITLE Sample property
LEGEND_SHAPES 2 2 2
LEGEND_COLORS #00B2EE #8B6914 #C4C4C4
LEGEND_LABELS Freshwater Terrestrial Other
#=================================================================#
# all other optional settings can be set or changed later #
# in the web interface (under 'Datasets' tab) #
#=================================================================#
#largest symbol will be displayed with this size, others will be proportionally smaller.
MAXIMUM_SIZE 50
#Internal tree nodes can be specified using IDs directly, or using the 'last common ancestor' method described in iTOL help pages
#=================================================================#
# Actual data follows after the "DATA" keyword #
#=================================================================#
#the following fields are required for each node:
#ID,symbol,size,color,fill,position,label
#symbol should be a number between 1 and 5:
#1: rectangle
#2: circle
#3: star
#4: right pointing triangle
#5: left pointing triangle
#6: checkmark
#size can be any number. Maximum size in the dataset will be displayed using MAXIMUM_SIZE, while others will be proportionally smaller
#color can be in hexadecimal, RGB or RGBA notation. If RGB or RGBA are used, dataset SEPARATOR cannot be comma.
#fill can be 1 or 0. If set to 0, only the outline of the symbol will be displayed.
#position is a number between 0 and 1 and defines the position of the symbol on the branch (for example, position 0 is exactly at the start of node branch, position 0.5 is in the middle, and position 1 is at the end)
DATA
#Examples
#internal node will have a red filled circle in the middle of the branch
#9606|184922,2,10,#ff0000,1,0.5
#node 100379 will have a blue star outline at the start of the branch, half the size of the circle defined above (size is 5 compared to 10 above)
#100379,3,5,#0000ff,0,0
#node 100379 will also have a filled green rectangle in the middle of the branch, same size as the circle defined above (size is 10)
#100379,1,10,#00ff00,1,0.5
S1005 2 50 #00B2EE 1 1
S1023 2 50 #00B2EE 1 1
S1026 2 50 #00B2EE 1 1
S1027 2 50 #00B2EE 1 1
S1028 2 50 #00B2EE 1 1
S1038 2 50 #00B2EE 1 1这个需要设置的就多了，包括符号位置、形状、颜色、大小等，上面都有详细解释，注释效果如下所示：
这时候在Controls框的Datasets中就可以看到刚刚上传的数据集，如果对刚才注释文件的设置不满意这时候也可以调整各种参数，同时还出现了一个Datasets框，用于显示已经上传的注释数据集，点击其右边的设置按钮就可以编辑改数据集信息。还可以使用dataset_external_shapes_template.txt添加外部符号，如下所示：
使用colors_styles_template.txt设置标签的背景颜色：
使用dataset_color_strip_template.txt添加彩色条带：
使用dataset_heatmap_template.txt添加热图：
使用dataset_simplebar_template.txt添加条形图：
绘制完成后，在Controls框的Export栏下输出图像，推荐SVG和PDF两种格式，如下所示：
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