高通量测序的分子实验基础：DNA提取与处理

关于DNA的分子生物学试验是生物信息学研究的第一步，也是整个流程的基础，DNA质量的好坏直接关系到后续测序分析的成败。

01

DNA提取

DNA提取一般包括以下几个步骤：

①细胞裂解，可以采取的方法有多种，主要可分为机械破碎法（振荡珠磨、液氮研磨、反复冻融等）和酶解法（如溶菌酶溶解细菌细胞壁），一般需要预先加入保护液（如TE buffer）来溶解DNA并防止其降解，此外也可以在破胞前加入去垢剂来去除杂质并破坏细胞（如SDS是一种表面活性剂，能破坏细胞膜上的脂质，并在低温下使其沉淀）；

②去除杂质，例如细胞碎片、蛋白质、RNA、腐殖酸等，常用的方法有化学法（加入抑制因子沉淀杂质、使用氯仿等有机溶剂溶解杂质）、酶解法（例如蛋白酶K、RNA酶降解蛋白质、RNA）；

③回收DNA，将混合体系中的DNA进行回收，主要方法有醇沉淀法（DNA不溶解于异丙醇、乙醇等）、过柱收集法（DNA在高盐环境下可以吸附在硅胶滤膜上，这是大部分试剂盒采用的方法）、磁珠吸附法（DNA分子通过氢键吸附到具有磁性的磁珠上，然后在磁场中分离磁珠，常见于自动提取仪）；

④清洗溶解DNA，对沉淀的DNA、收集柱DNA以及磁珠吸附的DNA使用70%乙醇清洗，最后待乙醇挥发后使用无菌水溶解DNA。

对于不同类型的生物样本，其DNA提取方法略有不同，尤其是对于环境样本，需要更多预处理来去除杂质，但总的来说，DNA提取总则如下：

a.保证核酸一级结构的完整性；

b.核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

c.其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

d.其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

02

PCR扩增

PCR也即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是利用DNA聚合酶通过控制温度梯度来实现的一种DNA分子的胞外扩增。基于扩增基因组DNA中的某个特定小片段（例如16S rRNA基因的高变区）的测序分析称为扩增子测序，扩增的片段作为marker基因来分析微生物群落。

常见的PCR的反应循环如下所示（具体温度和时间因酶而异）：

由于DNA聚合酶只能在5'端缺口添加碱基，故需要引物的帮助来进行复制，引物一般设计在可变区两端的保守区，并通过简并碱基的使用来增强其通用性。由于高通量测序一次测序量很大，一般将多个样品混合在一起上机测序，为了对不同样品的序列进行区分，在合成引物时设计了特异性的barcode序列，通过PCR反应将barcode序列添加到样品所有小片段中，如下图所示：

需要注意的是，实际的PCR反应不是一种指数扩增，扩增子的数目更趋近于S型曲线，随着反应进行，引物、dNTP不断被消耗，DNA聚合酶的活性也会降低，导致错配率升高等问题，因此PCR循环次数并不是越大越好。

扩增完毕后，将不同样品的扩增子片段混合并通过琼脂糖凝胶电泳、割胶回收的方法进行片段纯化。

03

鸟枪法打断

鸟枪测序（Shotgun sequencing）是将大分子的目标DNA随机地处理成大小不同的小片段进行测序，并在后续的生物信息学分析中将这些短序列组装成目标DNA的技术方法。由于测序技术读长的限制，在基因组、宏基因组测序中，对基因组DNA进行鸟枪法打断是必需的步骤。

在传统的测序技术中，使用限制性内切酶对目标DNA上的限制性内切酶识别位点进行切割，从而形成小片段。而新一代的高通量测序技术中，常使用机械法（例如超声波DNA破碎）使大分子DNA形成在一定长度范围内分布的短序列片段。鸟枪法打断产生的小片段其序列长度服从正态分布，例如微生物基因组DNA经过90s超声波打断成约350bp的小片段，建库后的文库片段（加上接头为500bp左右）经Agilent 2100测试长度分布如下所示：