宏基因组binning：MetaBAT
基于reads比对注释的物种binning可以获得宏基因组微生物群落的物种组成信息，但无法获得组成物种的基因组。要获得这些基因组数据，还需要基于不同基因组的特征对拼接的contigs进行binning。目前基于contigs binning的方法使用非常广泛，也已经开发了多种软件，其中最高引用次数的两款为MaxBin和MetaBAT。这两款软件均支持使用多样本拼接的contigs来提高binning的成功率，也即根据contigs在多个library中丰度的相关性（co-abundance pattern）来进行聚类。
宏基因组分析Pipeline
宏基因组binning: Metabat
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MetaBAT（https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat）是基于contigs丰度和四联核苷酸频率（tetranucleotide frequency，TNF）进行binning的软件，其原理是在不同微生物的DNA中，短的寡核苷酸序列并不是均一的分布的，这些寡核苷酸频率呈现出物种特异性的概率模型，相近物种的DNA序列一般都会拥有相似寡核苷酸概率的模型。在binning分析中MetaBAT首先计算每个contig的TNF，然后计算每个contig的丰度，接下来根据这两个信息计算contigs两两之间的距离矩阵，并通过迭代进行聚类[1]。
MetaBAT使用修改的k-medoids聚类算法进行迭代binning。MetaBAT首先会选取具有最大覆盖率的序列作为种子序列（seed contig），将其作为初始的中心点（medoid），然后根据设定的距离阈值（cutoff distance），直到其他所有contigs与种子序列的距离均大于此值，然后在剩余的contigs中选择一个contig作为第二个medoid，重复上一步，将这两个medoid所引入的contigs作为一个bin。以上步骤为一次迭代，不断迭代获得所有的bins，其余的序列作为free contigs，假如样本量大于设定值，根据丰度相关性将free contigs再次引入bins来提高敏感度（sensitivity）。
与其初始版本相比，更新版本MetaBAT 2能够根据数据确定最佳的参数，在大多数情况下其参数默认值都非常可靠，然而当样本容量很大、序列组装质量很好时MetaBAT 1可能会胜过MetaBAT 2。实际情况往往是复杂多变的，MetaBAT 1可调参数更多，与其把MetaBAT 2看成MetaBAT 1的升级版本，倒不如看成其简化版本，因此这里以MetaBAT 1的使用为例进行介绍。
MetaBAT 1的基本参数如下所示：
-i，--inFile：必需参数，fasta格式的contigs文件
-o，--outFile：必需参数，结果bin文件的文件名前缀，默认为fasta格式，除非设置了-l参数
-a，--abdFile：contigs丰度文件，包含碱基覆盖率的均值和方差，可以使用内置的jgi_summarize_bam_contig_depths命令计算
--cvExt：使用其他方法产生的没有方差的覆盖率文件
-p，--pairFile：含有paired reads比对信息的文件，用来提高灵敏度，一共有三列，第一列contigs名称，第二列配对的contigs名称，第三列平均覆盖率
--p1：对种子序列引入contigs的概率阈值，也即引入的序列和seed contigs属于一个基因组的可能性的最低值，介于0到100之间，该值会影响bins的数目与精确度，其值越小，bins数目越小，敏感度越高，精确度越差
--p2：对第二个中心引入contigs的概率阈值，最好设置的和p1接近
--minProb：一条contigs属于一个bin的可能性的最低值（综合两次中心划分的结果），该值决定了binning的敏感度，最好设置>= 75
--minBinned：已经bin的序列占该基因组推断大小的比例（相当于基因组完整度），该值会影响精确度，应该设置<= 50
--verysensitive：更高的敏感度，尤其是在简单群落中，就相当于以下参数设置：--p1 90 --p2 85 --pB 20 --minProb 75 --minBinned 20 --minCorr 90
--sensitive：较好的敏感度（默认值），就相当于以下参数设置：--p1 90 --p2 90 --pB 20 --minProb 80 --minBinned 40 --minCorr 92
--specific：较好的精确度，当多样品binning时可以使用，就相当于以下参数设置：--p1 90 --p2 90 --pB 30 --minProb 80 --minBinned 40 --minCorr 96
--veryspecific：更高的精确度，对于短序列不使用丰度相关性聚类，就相当于以下参数设置：--p1 90 --p2 90 --pB 40 --minProb 80 --minBinned 40
--superspecific：最好的精确度，相当于以下参数设置：--p1 95 --p2 90 --pB 50 --minProb 80 --minBinned 20
--minCorr：使用多样品丰度相关性聚类时皮尔森相关性阈值，应该设置>=90来减少污染
--minSamples：当使用contig多样本co-abundance pattern进行聚类时包含该contig的最小的样本容量，默认为10
-x，--minCV：计算丰度距离矩阵时最低的contig单个文库覆盖率，低于此阈值的contigs被舍弃，默认为1
--minCVSum：计算丰度距离矩阵时最低的contig多个文库覆盖率之和，低于此阈值的contigs被舍弃，默认为2
-s，--minClsSize：bin的最小减基数，低于此阈值的bins不会在结果中输出，默认为200000也即约200K，如果需要保留质粒和病毒需设置较低size
-m，--minContig：contigs最小减基数，低于此阈值的contigs在bining之前舍去，默认为2500，此参数应该大于1500，最好大于2500，如果多样品且样品数目大于等于--minSamples设定的值，大于1000的序列都会被保存
--minContigByCorr：用于计算多样本丰度相关性的contigs最短长度，默认为1000，只有样品数目大于等于--minSamples设定的值时有效，如果--minContigByCorr设定的值大于--minContig则失效
-t，--numThreads：程序运行使用的核数，默认使用所有核
--minShared：arg (=50) Percentage cutoff for merging fuzzy contigs
-l，--onlyLabel：在每个bin文件中只列出contigs名称而不列出其序列
-V，--maxVarRatio：忽略方差/均值超过此阈值的contigs，默认为0
--saveTNF：保存contigs的TNF 矩阵数据
--saveDistance：保存contigs之间的距离矩阵
--saveCls：保存矩阵格式的聚类结果
--unbinned：输出在binning中舍弃的contigs序列
-B，--B：整体binning时自助抽样的次数，建议设置>=20，默认0（失效）
--pB：自助抽样时共有成分的比例，默认为50，其值越高精确度越高
--keep：保留中间过程文件
-d，--debug：调试信息输出
-v，--verbose：备份信息输出使用MetaBAT 1进行binning，首先使用bam文件计算contigs覆盖度（也即深度depth），结果如下所示：
jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth contig.depth.txt spades.contig.reads.sorted.bam假如是多样品混合拼接，则可以在命令后添加不同样品的多个bam文件，不同bam文件使用空格隔开，如下所示：
jgi_summarize_bam_contig_depths <options> sortedBam1 [ sortedBam2 ...]关于bam文件的生成可参考往期文章Contigs与Gene丰度计算。
分析结果如下所示：
其中第一列为contigs名字，第二列为contig长度，第三列为总平均覆盖率，第四列为特定的bam文件的平均覆盖率，第五列为特定的bam文件的覆盖率方差，这里只有一个样品、一个文库，也只有一个bam文件，若是多样品拼接，则会有对应的文库的覆盖率及方差。接下来进行binning，如下所示：
nohup metabat1 -i new.spades.contig.fasta -a contig.depth.txt -o twk --sensitive -t 20 -v > log.txt &运行结束后，就会产生一系列的用数字区分的fasta文件，即分装后的bins文件。
参考文献：
[1] Kang D D, Froula J, Egan R, et al. MetaBAT, anefficient tool for accurately reconstructing single genomes from complexmicrobial communities[J]. Peerj, 2015, 3(8): e1165.
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