m6A结合单细胞转录组打造5分+SCI

大家好！今天给大家介绍一篇2022年5月发表在Journal of Translational Medicine（IF：5.531）上的一篇文章。作者对结直肠癌患者的单细胞转录组数据进行分析，分别鉴定m6A介导的TME细胞亚群并鉴定这些细胞亚群的预后价值和预测免疫治疗反应的价值。

Single-cell N6-methyladenosine regulator patterns guide intercellular communication of tumor microenvironment that contribute to colorectal cancer progression and immunotherapy

单细胞N6甲基腺苷调控因子模式指导肿瘤微环境的细胞间通讯，有助于结直肠癌的进展和免疫治疗

摘要

背景：N6-甲基腺苷（m6A）RNA甲基化在各种癌症的关键遗传事件中发挥关键作用。然而，m6A在肿瘤微环境（TME）中的作用尚不清楚。

方法：对33例CRC癌症样本的65362个细胞的单细胞转录组数据进行分析，使用CRC数据集和免疫治疗数据集鉴定与预后和免疫反应有关的TME簇。

结果：成纤维细胞，巨噬细胞，T细胞和B细胞分别聚为4-5个亚群，根据不同的生物学过程和标记基因进行分类。此外，作者揭示m6A RNA甲基化调控因子可能与CRC的临床和生物学特征及主要TME细胞类型的时间轨迹显著相关。转录组数据分析表明，m6A介导的TME细胞亚群具有显著的预后价值并且可以区分接受ICB治疗有反应组和无反应组。CellChat分析表明TME细胞的RNA m6A甲基化相关细胞亚型表现出与肿瘤上皮细胞的多样化和广泛的相互作用。进一步分析表明，MIF-(CD74+CXCR4),MIF-(CD74+CD44),MDK-NCL和LGALS9-CD45的配体-受体对介导了TME细胞m6A相关亚型与肿瘤上皮细胞的通讯。

结论：总的来说，作者的研究首次揭示了m6A甲基化介导肿瘤微环境的细胞间通讯在调节肿瘤生长和抗肿瘤免疫调节中的作用。

流程图

结果

1. 数据集的获取和下载

本研究收集了23例CRC患者的单细胞转录组数据集GSE132465，包括23例肿瘤样本和10例正常样本，分析23个m6A RNA甲基化修饰调控因子的情况。从GEO数据库和TCGA数据库获取11个公共数据集。

2. CRC样本的TME细胞的m6A调控因子

作者使用CRC的单细胞转录组数据集研究m6A RNA甲基化调控因子的情况（图1A）。该数据集包括来自23例CRC患者的33个样本的65362个TME细胞，包括上皮细胞，肥大细胞，髓细胞，基质细胞，T细胞和B细胞（图1B）。细胞通讯分析表明这些细胞类型之间具有相互作用（图1C）。作者评估了在不同样本类型，MSI状态，年龄分组，AJCC分期和性别分组中m6A调控因子的表达水平差异（图1D）。SMC数据集表明6个细胞类型中m6A调控因子的表达水平的差异（图1E）。图1F为m6A特异性NMF簇中四个免疫细胞类型的比例。

图1 单细胞转录组数据集中m6A甲基化调控因子的水平

3. m6A介导的成纤维细胞有助于CRC患者的TME

伪时间轨迹分析表明m6A RNA调控因子在成纤维细胞，NK细胞，巨噬细胞，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的轨迹中起到重要作用（图2A）。细胞通讯分析表明m6A相关成纤维簇和上皮细胞簇之间有不同数量的配体-受体对（图2B）。肿瘤样本中WTAP+CAF-C2的比例较高（图2C）。KEGG富集分析表明，WTAP+CAF-C2簇具有IL-17活性，TNF信号和中性粒细胞相关功能。WTAP+CAF-C2打分与炎症CAF密切相关（图2E）。基因调控网络分析表明26个TFs在4个簇中存在显著差异，其中REL,CEBPB,FOSL1,POU2F2,NFKB1,IRF1和ETS1在WTAP+CAF-C2簇中上调（图2F）。通路热图表明这些通路相关基因在WTAP+CAF-C2和NoneMethy-CAF-C4中显著差异表达（图2G）。富集图表明，HNRNPA2B+CAF-C1，WTAP+CAF-C2和NoneMethy-CAF-C4具有不同的REACTOME通路特征（图2H）。

图2 纤维细胞的m6A调控因子的修饰特征

4. m6A介导的巨噬细胞与经典特征类似

本研究共包括5822个巨噬细胞，可以分为肿瘤相关巨噬细胞和正常巨噬细胞。共获得5个m6A-mac簇，包括4个表达m6A调控因子簇（WTAP+mac-C1，HNRNPC+mac-C2，HNRNPA2B1+mac-C3和YTHDC1&YTHDF3+mac-C4）和一个没有表达m6A调控因子簇（NoneMethy-mac-C5）（图3A）。使用R包Seurat的AddModulScore功能发现WTAP+mac-C1与促炎性巨噬细胞显著相关，HNRNPA2B1+mac-C3与与SPP1+和C1q+巨噬细胞显著相关（图3B和3C）。此外，SCENIC分析表明WTAP+mac-C1和HNRNPA2B1+mac-C3的TF活性不同（图3D）。GSVA分析鉴定到有41条通路在5个m6A-mac簇中具有显著差异（图3E）。WTAP+mac-C1，HNRNPA2B1+mac-C3和YTHDC1&YTHDF3+mac-C4具有不同的REACTOME通路特征（图3F）。

图3 m6A调控因子有助于产生肿瘤相关巨噬细胞

5. m6A介导T/B细胞表型强调了CRC中的抗肿瘤免疫反应

23115个T细胞共分为8个细胞亚型，包括CD4+，CD8+，Treg，NK，T辅助细胞和T滤泡辅助细胞等（图4A）。NMF共鉴定到5个m6A相关T细胞簇，分别为甲基-T-C1至甲基-T-C5（图4B），在这5个m6A相关T细胞簇和肿瘤上皮细胞中配体-受体对数量不同（图4C）。网络调控分析表明，这5个m6A相关T细胞簇中TFs显著差异表达（图4D）。此外，为了评估m6A相关T细胞簇对T细胞的影响，作者鉴定到一些共刺激，共抑制免疫基因和功能相关标记基因差异表达。CD4+ T，CD8+ T，Treg和NK T细胞中不同m6A簇的共刺激，共抑制免疫基因和功能相关标记基因差异表达，并且T功能特征存在差异（图4E）。对于9146个B细胞，NMF分析鉴定到4个m6A相关B细胞簇，其中IgG+ plasma B细胞，IgA+ plasma B细胞和CD19+CD20+ B细胞的比例在4个簇中没有显著差异（图4F-4H）。然而，4个簇中TF活性具有显著差异（图4I）。

图4 T细胞和B细胞的NMF 分析的m6A簇

6. m6A介导的TME模式有助于CRC的预后和免疫治疗

首先，作者鉴定scRNA数据集的DEGs并提取排名前30的细胞标记物。根据m6A介导的TME细胞的DEGs使用GSVA计算m6A打分，并使用meta分析研究各类TME细胞的m6A打分对CRC患者和泛癌的OS和RFS的作用（图5）。随着各类m6A介导的细胞亚群中m6A基因的变化，作者发现不同细胞亚群的RFS和OS具有显著差异（图5A和5B）。此外，作者使用logistic回归研究m6A相关TME细胞是否可以预测患者对免疫治疗的反应（图5C）。

图5 m6A相关细胞类型对预后和免疫治疗反应的作用

7. m6A介导的TME模式增强细胞间通讯

通过细胞间通讯分析作者鉴定到从m6A亚群到肿瘤上皮细胞的细胞间通讯配体-受体对（图6A），其潜在机制如图6B所示。

图6 细胞间通讯分析

结论

总的来说，作者首次使用单细胞转录组数据鉴定特异性m6A修饰的TME细胞亚型，揭示了m6A甲基化介导的肿瘤微环境细胞间通讯在调控肿瘤生长和抗肿瘤免疫调节中的作用。本研究的局限性在于scRNA-seq的测序深度较低，样本量较少，本研究的结果还需要使用额外数据集进行验证。

参考文献: Gao Y, Wang H, Chen S, et al.Single-cell N-methyladenosine regulator patterns guide intercellular communication of tumor microenvironment that contribute to colorectal cancer progression and immunotherapy. J Transl Med 2022 May 04;20(1). 详情可查看原文链接，欢迎大家学习引用。https://translational-medicine.biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/s12967-022-03395-7.pdf