单细胞测序揭示肝移植术后细胞图谱

近日肝移植领域发表一篇单细胞测序文章，题目为Landscape of Immune Cells Heterogeneity in Liver Transplantation by Single-Cell RNA Sequencing Analysis，由青岛大学附属医院器官移植中心蔡金贞教授团队完成。

排斥是影响肝移植术后患者长期生存的重要因素，其潜在机制不明，需要进一步探索。在肝移植术后移植物免疫微环境中，免疫细胞同其他类型细胞相互作用，参与了排斥发生。该研究通过单细胞测序等技术，揭示了肝移植术后免疫细胞异质性图谱。T细胞、髓系细胞在内的免疫细胞在人肝脏及外周血样本中呈现出不同的组织分布，表达及功能差异。该研究发现，相对于正常肝组织，CCR6+CD4+ T细胞、耗竭性CTLA4+CD8+ T细胞和增殖性MKI67+CD8+ T 细胞在移植肝中占比显著增高，CD1c+ DC, CADM+DC, MDSC, and FOLR3+ Kupffer cells也体现中同样趋势。该研究首次揭示了LDLR分子作为活化的MDSC分子标记物可以抑制排斥发生。并且发现CD4+CD8+FOXP3+ T存在于CTLA4+CD8+ T细胞中。胞间分析提示LDLR+ MDSC通过TIGIT-NECTIN2信号通路作用于CTLA4+CD8+ T细胞。

结果

人肝移植术后单细胞图谱构建

该研究采用10X genomics对肝移植术后肝穿及外周血标本进行单细胞测序，过滤后拿到68,172细胞。同PBMCs相比，肝组织来源细胞高表达CXCR4和CCL3L1。进一步根据marker基因标记了6种细胞，包括T细胞、NK细胞、B细胞、髓系细胞、内皮细胞和成纤维细胞，其中T、NK和髓系细胞占比较高。

T细胞分群及亚型分析

对31,300个肝脏T、NK细胞进一步分群分析，拿到15个cluster，包括7群CD8 T细胞、3群CD4 T细胞、1群DNT细胞和2群NK细胞。并进一步对各细胞进行细胞毒性、调节性、增殖性、耗竭性等功能状态标记，发现耗竭性CD8 T细胞和增殖性CD8 T细胞占比较高，拟时序分析发现增殖在前，耗竭在后。

耗竭性CD8 T细胞特殊表型

耗竭性CD8 T细胞在移植肝中占比较大，该研究对这群细胞进一步标记，发现其除了表达CTLA4、LAG3和PDCD1之外，也特定性表达HAVR2, TIGIT和DUSP4分子。该研究利用免疫组化对PD1在移植肝的表达情况做了进一步验证。对该亚群差异表达基因通路富集分析显示，其大量富集在T细胞的各种功能通路，特别是免疫检查点。利用bulk-RNA seq数据，确认了CTLA4和LAG3基因在移植排斥中显著高表达。利用CIBERSORT反卷积化算法证明，排斥标本中CD8+ T细胞占比更高。

作者对该群耗竭性CD8 T细胞进一步分群，发现了同样表达CD4和FOXP3的细胞亚群，处于分化的初始阶段，并使用免疫荧光进行了细胞验证。

不同髓系细胞驻留于肝组织内

该研究对髓系细胞进一步分群，拿到了树突状细胞、kupffer细胞、巨噬细胞和单核细胞在内的14群细胞，其中kupffer细胞是用MARCO, TIMD4, CD5L和VCAM1等经典marker标记的。

LDLR+MDSC特殊表型

该研究发现LDLR+巨噬细胞在移植物扩增，进一步细胞标记发现其高表达TMEM176B, S100A8, 和S100A9，故将其标记为一群骨髓来源的抑制性细胞MDSCs。作者用流式、免疫荧光、免疫组化、通路富集、反卷积化等手段对该群细胞进一步证明。

TIGIT-NECTIN2通路参与CTLA4+耗竭性CD8T细胞和LDLR+MDSC相互作用

这是一篇常规的单细胞测序数据分析文章，但其作为肝移植领域可能的首篇单细胞文章，具有一定意义。

原文链接：https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.890019