10X空间转录组之免疫组库分析

疫情即将过去，大家期间过的怎么样？无论疫情如何，科研一直在路上，并且在不断的推陈出新，而我们今天要分享的就是10X空间转录组的免疫组库分析。

关于免疫组库，在单细胞的研究中已经很普遍，无论是TCR还是BCR都有了广泛的运用，然后在空间分析上，VDJ的空间分布仍然是一片处女地，但是研究价值不言而喻，但是在目前的研究中，空间转录组在免疫组库方面的研究乏善可陈，一方面是由于空间转录组测到的是3’区域，而VDJ的变体结构富集在5’；另一方面VDJ在一个免疫细胞中通常成对出现，而空间转录组的精度目前均没有细胞级，10X空间转录组的精度为55um，而Stereo-seq是纳米级精度，所以无法像单细胞一样检测到VDJ对。尽管如此，还是有文章和方法可以解决这个问题，我们来看看空间转录组免疫组库的运用和方法。

应用一：Spatial B cell receptor (BCR) profiling identifies in situ hypermutation and clonal selection

在文章Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer中，TLS（三级淋巴结构） 中 B 细胞成熟亚型和 PC 的共定位暗示了原位 B 细胞适应性免疫的产生。在此过程中，B 细胞会突变其 B 细胞受体 (BCR) 序列，并选择和扩增最亲和的克隆。为了证明这些事件，有必要研究 BCR 的核苷酸序列。Visium 空间技术基于条形码转录本的 RNA 测序，这能够访问原始转录本并执行空间 BCR repertoire 分析。使用了公开可用的方法 MiXCR，这是一种旨在从 50 个 RNA 测序数据中识别 BCR IgL 和 IgH 克隆型及其种系体细胞超突变的工具，以及 30 Frozen Visium 试剂盒，它使我们能够获得足够长度的 mRNA 转录物捕获大多数 IGL 和一些 IGH 序列的完整互补决定区 (CDR)3 区域。通过 3 倍推荐深度（每个点 150,000 个读数，相当于每个样本 2.25 亿个读数）的测序促进了这种捕获。MiXCR 鉴定了许多独特的克隆型：总共 3,015 个 λ 轻链、3,084 个 kappa 轻链和325 重链。在 TLS+ 肿瘤中发现了最多的独特克隆型和总 Ig 计数。在 TLS 区域也发现了数量最多的独特轻链克隆型。通过测量 Ig 轻链序列的 V 区的突变计数与映射的 V 种系基因进行比较来评估 B 细胞成熟。中位 V 基因突变计数在 TLS 区域中显示低至中位水平，并且引人注目的是，在肿瘤区域中远离 TLS 的大部分是高度突变的序列。尽管如此，在 TLS 区域测量了全范围的突变，包括高度突变的序列，而距 TLS 一定距离的大多数 Ig 转录物富含高度突变的序列，表明体细胞超突变发生在 TLS 中，并表明突变的 PC 在整个肿瘤中迁移. 研究了来自 47 个 ccRCC 肿瘤（包括 Visium 分析的 12 个冷冻肿瘤）的bulk 50 个 RNA-seq 中的轻链和重链突变计数，这些肿瘤使用 TLS 印记特征的中值表达被分类为 TLS 高或低。对于 VL（中位 TLS 高 = 12 个突变，中位 TLS 低 = 8 个突变，p = 0.0163）和 VH 基因（中位 TLS 高 = 19），TLS 高与 TLS 低肿瘤的总体体细胞超突变水平显着更高突变，中位 TLS 低 = 13.5 个突变，p = 0.0227）。为了确定体细胞超突变是否伴随着克隆型选择，研究了bulk 50 RNA-seq 数据的 IgH 库。高 TLS 样本的所有样本都表现出大量的总克隆型计数以及计数超过 100 次的更高比例的克隆型。事实上，30% 的 TLS 高肿瘤库被识别超过 100 次的克隆型占据，而 TLS 低肿瘤中这一比例为 1% (p = 10e-7)，揭示了 TLS 高样本中持续的免疫反应。相反，TLS-low 样本显示出较少的多样性，计数较低，大多数被测量不到 10 次，除了一个肿瘤有 123 个 IgH 克隆型，只有 2 个被计数超过 100 次。

最后，为了确定扩增的 IgH 克隆型的克隆关系和位置，对 30 个 RNA-seq 空间数据进行了克隆性评估。克隆性由相同的 VH 基因家族、相同的 JH 基因和相同的 CDR3 长度以及 VH 序列之间的 CDR3 核苷酸序列的最大差异为 15% 来定义。为了可视化这些关系，计算了每个 VH CDR3 序列之间的 Levenshtein 距离，并用 TLS+ 肿瘤的圆形树表示它。总共确定了 31 个具有 2 至 16 个独特成员的克隆家族。在一个家族中，一些克隆可以在多达 20 个不同的空间位置被检测到多达 80 次。IgH 克隆型在 Visiumslide 上的定位证明了同一家族的克隆型聚集在 TLS 附近并在远处稀疏迁移。一些克隆型甚至可以在距它们所在的 TLS 区域高达 3 mm 处检测到可能已经生成。为了证实这些结果，在从配对的bulk 50 RNA-seq 推断的克隆型中寻找从空间 30 RNA 转录组学鉴定的克隆型的 CDR3 核苷酸序列。克隆家族 1 的 CDR3 序列 CATYNAGEGGRGYW 的克隆型也在bulk 50 个 RNA-seq 数据中发现，从而证实了分析的结果。此外，这些克隆型位于 TLS 内部和远离 TLS 的位置，表明相应 B 细胞克隆的迁移。

在 TLS-low 样本中，检测到的克隆型数量非常少，阻止了对 Ig 转录物的分析，也支持了肿瘤内 PC 主要在 TLS 中产生的假设。总之，这些数据支持原位 TLS 介导的成熟，允许在肿瘤的各个区域选择、克隆扩增和传播选定的PC。

应用二、癌症空间转录组TCR的检测运用

空间转录组学可以测定空间区域的基因表达，方面研究者们识别细胞的空间分与空间临近处的相互作用。其中，对于免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用的研究尤其突出，对肿瘤组织适应性免疫过程的详细了解需要研究 B 和 T 细胞受体的VDJ序列，这些序列决定了淋巴细胞抗原的特异性，并可以作为淋巴细胞克隆的标签。抗原受体测序已经在单细胞中获得了广泛的运用，但是中空间上仍然需要方法的改进，于是在文章Localization of T cell clonotypes using spatial transcriptomics中提出了一种从 10X Genomics 的 Visium 空间基因表达平台确定 T 细胞受体 (TCR) 序列的方法。允许研究VDJ的空间分布特征。

TCR的空间分布特点，最直观的分析就是能够识别浸润肿瘤组织的TCR序列，具有十分重要的生物学意义，对于指导临床运用，体外培养具有浸润肿瘤的免疫细胞（拥有超突变的VDJ pairs）作为靶向治疗等方面的研究提供了依据。

空间VDJ检测的分析原理

空间VDJ文库构建示意图：

最关键的地方在于5’端VDJ区域的富集，结合空间位置的Barcode信息，达到空间检测VDJ的目的。Visium 空间转录组学平台可以捕获空间位置的mRNA。每个探针在 5' 端包含部分 Read 1 序列、16 个核苷酸的空间条形码、12 个核苷酸的唯一分子标识符 (UMI) 和 3' poly(dT) 尾。一开始使用read1序列对cDNA进行扩增，保留可以识别空间位置的Barocode序列和UMI序列。在成像和组织透化后，多腺苷酸化的 RNA 分子与 poly(dT) 尾部退火，允许随后的逆转录以扩展 ssDNA 探针以包含 cDNA 序列和添加的模板转换序列。第二条链是用与模板转换序列互补的引物产生的。该洗脱的第二条链被扩增以形成全部的cDNA序列，保留全部的序列信息，该文库具有空间Barcode和 UMI，位于 poly(A) 尾的 3' 端。

为了生成包含 TCRβ 的 CDR3 区域以及 UMI 和包含位置信息的空间条形码的 cDNA 分子，TCRβ 扩增必须在 TCR 的 5' 端使用引物进行。由于 TCRβ 恒定区位于 CDR3 的 3' 端，因此需要一组可变 (TRBV) 基因引物来生成包含 CDR3 和空间信息的 cDNA 分子。使用来自 Visium 测定的扩增 cDNA 作为模板，使用该修饰的 TRBV 引物池和 Read 1 引物进行 PCR，以生成富含 TCR 的文库。虽然标准的 Visium 基因表达方案要求对 cDNA 文库进行片段化，但 此处生成的富含 TCR 的库不能在不丢失 TCR 和空间条形码序列之间的联系的情况下进行分段。因此，富含 TCR 的 cDNA 文库通过珠子纯化进行纯化，并直接进行样本index PCR 以进行双端测序。

在当前的研究中，在 Illumina MiSeq 仪器上进行了读取长度≥150 个核苷酸的双端测序。为了分析，read2 经受 MiXCR pipeline以识别存在的 TCR 和支持每个识别的 TCR 序列的read。从配对read 1 中识别出 UMI 和空间条形码，以校正扩增偏差并将 TCR 与空间位置匹配。

空间VDJ的重要意义

空间VDJ的研究不是简单的提供了VDJ的空间分布信息，更多的是在不同的实验条件下，VDJ分布所揭示的生物学意义。B细胞IGH超突变的迁移和浸润，为癌症的免疫治疗提供了新的契机，也充分认识到免疫细胞的迁移之伴随着其他细胞类型的辅助完成的。T细胞VDJ序列的空间分布，尤其浸润肿瘤组织的对肿瘤细胞的杀伤作用，对临床研究有重大意义。总之，空间免疫组库是一个全新的技术领域，未来一定会在生物学研究、临床应用方面发挥巨大的作用。