单细胞转录组揭示磷酸化相关基因在肝细胞癌干细胞中的作用

前言

题目：Single-Cell RNA Sequencing Reveals the Role of Phosphorylation-Related Genes in Hepatocellular Carcinoma Stem Cells 日期：2022-01-04 期刊：Front Cell Dev Biol DOI：https://doi.org/10.3389/fcell.2021.734287

摘要

蛋白激酶和磷酸酶的异常激活与各种肿瘤发生有关，包括肝细胞癌 (HCC)。晚期 HCC 患者接受全身治疗，比如使用延长总生存期的酪氨酸激酶抑制剂。研究蛋白激酶信号传导的潜在机制将有助于提高 HCC 治疗的疗效。结合单细胞 RNA 测序数据和 TCGA RNA-seq 数据，分析了HCC 患者的蛋白激酶、磷酸酶和其他磷酸化相关基因 (PRG)。发现了主要在 HCC 癌症干细胞中检测到的 9 种高表达蛋白激酶和 PRG，包括POLR2G、PPP2R1A、POLR2L、PRC1、ITBG1BP1、MARCKSL1、EZH2、DTYMK和AURKA。TCGA 数据集的生存分析表明，这些基因与 HCC 患者的不良预后相关。进一步的相关性分析表明，这些基因参与了可能导致 HCC 发展的细胞周期相关途径。其中，AURKA和EZH2被 Ingenuity Pathway Analysis 确定为两个枢纽基因。AURKA 抑制剂 (alisertib) 和 EZH2 抑制剂 (gambogenic) 治疗可抑制 HCC 细胞增殖、迁移和侵袭。还发现AURKA和EZH2在TP53-突变的HCC样本中均高表达。

异常磷酸化过程与肝细胞癌进展有关

TCGA 369例HCC+ GEO（GSE149614)中50个癌旁样本，在 HCC 组织中鉴定出 1,477 个上调基因和 720 个下调基因，发现上调的基因不仅富集在细胞分裂、T 细胞受体信号通路和其他在肿瘤发生过程中已被证实的特定通路，而且还富集了一些磷酸化-相关的 GO term，包括蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的负调节、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节和 MAPK 级联途径。下调基因与蛋白激酶 B 活性的激活和磷脂酰肌醇 3-激酶信号通路的正调控高度相关。

Cox 回归分析筛选出与预后最相关的前 500 个基因，其中 120 个和 13 个基因在癌组织中显著上调和下调。再结合GO进行筛选，确定了 20 个与预后相关且与蛋白激酶活性和功能密切相关的 DEG，其中有 18 个磷酸化相关基因（PRGs）的表达水平在 HCC 样本中显著上调，2个下调。生存曲线表明，HCC上调和PRGs表达水平较高的患者预后明显较差。其中，UCK2、MARCKSL1、NEK2、CHEK2、AURKA和DTYMK是蛋白激酶，其他的EZH2和PRC1是 PRG。此外，两个 HCC 下调基因（SLC11A1和ADRA2B）在 HCC 样本中显示出显著下调。这些基因的异常表达可能会导致 HCC 进展相关基因的磷酸化失调，从而促进肿瘤发生和肿瘤发展。推测这些重要基因可能参与蛋白质磷酸化，影响下游磷酸化相关通路，进而促进HCC的发生和发展。

scRNA-Seq 数据集表明 PRG 在癌症干细胞中的高表达

下载了 HCC 的 scRNA-seq 数据 (GSE149614)，其中包含来自 10 名患者的原发性肿瘤、门静脉癌栓 (PVTT)、转移性淋巴结和非肿瘤肝脏对照。确定了 12 种主要细胞类型，包括 CSC、肿瘤增殖细胞、骨髓细胞、CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、Treg 细胞、HSC、B 细胞、NK 细胞、浆细胞、恶性细胞和内皮细胞。

之前看所有 18 个 HCC 上调和 PRGs 都与预后不良相关，为了研究它们在 HCC 中的潜在位置，使用了 scRNA-seq 数据，发现 18 个 HCC 上调和 PRGs 主要在肿瘤相关细胞中表达，但不在免疫细胞中。在所有肿瘤相关细胞，如恶性细胞和芽肝细胞中，一定程度上都会检测到一些PRGs的表达。

一共确定了九个（DTYMK , EZH2 , ITGBP1 , POLR2G , POLR2L , PPP2R1A , PRC1、AURKA和MARCKSL1 ) 在 Cancer stem cells (CSCs) 中显著高表达的基因。进一步检查了它们在 HCC CSCs 中的表达。有趣的是，在所有 2795个 EPCAM + 肝 CSCs 中，大多数至少表达 9 个基因中的一个，而只有 106 个细胞仅表达EPCAM，这表明 9 个 PRGs 在肝 CSCs 中的关键作用。

PRGs 的表达与肿瘤分级和淋巴结转移状态有关

在高表达的重要PRGs中， POLR2G、PPP2R1A、POLR2L、PRC1、ITGBP1、MARCKSL1、EZH2、DTYMK和AURKA的表达水平增加伴随着肿瘤分级的增加，这表明这些基因的RNA丰度与较高的肿瘤等级和较低的肿瘤分化水平呈正相关。此外，淋巴结转移状态高，POLR2G、PPP2R1A、POLR2L、PRC1、ITGB1BP1、MARCKSL1、EZH2、DTYMK和AURKA的表达水平越高，说明了这些基因与淋巴结转移的潜在关系

PRGs 参与 HCC CSCs 的细胞周期转变

为了探索磷酸化相关基因如何影响HCC进展的可能机制，预测了每个重要PRG的共表达基因

发现不同的 PRG 在网络中共享许多相关基因，这些基因在细胞分裂、有丝分裂核分裂和 DNA 复制中富集，表明PRGs可能通过调节细胞周期相关基因如TOP2A、UBE2C和CENPN的表达来介导肿瘤干细胞的多种生物学过程。

UBE2C、TOP2A和AURKA的表达水平之间以及TUBB、UBE2T和MARCKSL1 的表达水平之间存在很强的相关性，表明UBE2C和TOP2A以及TUBB和UBE2T可能作为AURKA的潜在靶标并调节细胞周期