单细胞揭示Cd9+Cd271+ 干/祖细胞群和 SHP2 通路有助于调节肌腱从新生到成熟的转换

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文章题目：A Cd9+Cd271+ stem/progenitor population and the SHP2 pathway contribute to neonatal-to-adult switching that regulates tendon maturation 期刊：Cell Reports 影响因子: 1区 9.423 发表时间: 2022年4月26日 DOI：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110762

文献概述

问题：成熟腱鞘的再生能力低，受伤的肌腱很少能完全恢复。恢复功能性肌腱需要更全面地了解肌腱成熟的细胞和分子机制。与我们对胚胎期肌腱发育的深入了解相比，对肌腱的成熟知之甚少。

方法：结合了跟腱体内模型，单细胞转录组学和功能验证

结论：第7-14天是肌腱成熟的关键过渡阶段，神经生长因子（NGF）分泌Cd9+Cd271+干细胞/祖细胞群和受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路，主导这一过程。而SHP2是RTK信号传导的关键成分，影响肌腱成熟。

实验结果

第7天（P7）至P14是肌腱成熟的关键阶段

肌腱随时间逐渐发展成熟。为了系统地评估肌腱成熟，比较了P1，P4，P7，P10，P14和P28的跟腱。P1处圆形核细胞浸润了新生儿肌腱。从P1到P4，细胞表现出逐渐细长的核形态。细胞数量从P1到P14逐渐减少。到P28时，每个区域只剩下几个细胞。细胞外基质在产后肌腱生长期间在P7处开始可见卷曲生长，并在P14处变得明显。在发育过程中纤维直径的变化也增加了，新生儿肌腱仅由均匀的胶原纤维组成。

在此过程中基因表达的变化，重点是细胞分化（Scx，Mkx，Egr1和Nes）和基质产生（Col1a1和Tnmd）基因。在不同的时间点进行了主成分分析（PCA）。前两个组分在不同的时间点（P4和P7与P14和P28）适当地分离肌腱组织，P10位于中间。PCA图（G）显示了P7-P14时间轴上的过渡。结果表明，P7-P14是产后肌腱成熟过程的关键过渡状态。

scRNA-seq确定了早期产后肌腱的细胞异质性

在P7和P14处对小鼠尾部肌腱细胞进行了scRNA-seq。从800个单细胞经过滤后得到734个细胞，并分组为六个细胞群。基于差异表达基因的生物学功能和肌腱相关基因的表达注释：肌腱成纤维细胞1（簇0），肌腱成纤维细胞2（簇1），肌腱成纤维细胞3（簇2），干细胞（簇3），增殖细胞（簇4）和神经元细胞（簇5）。

三个肌腱成纤维细胞簇高度表达的I型胶原蛋白（Col1a1和Col1a2----原纤维细胞外基质（ECM）的基本构成）。由于最大的簇0（n = 255）主要由P7肌腱细胞和高度表达的胚胎基因Pbx4组成，因此该组为未成熟的细胞簇。来自0簇细胞参与核糖核蛋白复合物的生物合成和mRNA代谢过程的调节，表明早期产后肌腱细胞生长的活性生物合成特征。肌腱成纤维细胞2（簇1，n = 187）和肌腱成纤维细胞3（簇2，n = 158）主要由来自P14的细胞组成，两者都显示出经典ECM基因的高表达（Tnmd、Fmod 和 Thbs4），为成熟细胞簇。簇1中的细胞也高度表达Fbn1和Mfap5，与胶原原纤维组织有关。相反，簇2中的细胞主要由于机械刺激而表现出富集，对应于Sparc和Serpinf1的高表达（但是这个在簇1中表达也很高）。其余三簇主要来自P7肌腱。将簇3（n = 66）注释为具有高表达干细胞相关基因：Pou3f1（Oct6），Thy1（Cd90），Nes和Ly6a（Sca-1），GO显示在“干细胞群维持”中也显著富集。将簇4（n = 37）分配为具有特异性表达增殖标记Mki67的增殖细胞和G2M细胞周期阶段的高得分。神经元细胞（簇5（n = 31）高度表达神经元标志物Sox2 和 Nrgn，GO富集到了“神经发生调节”的生物过程。

在P7和P14肌腱中发现了Cd9+Cd271+ TSPC亚群和RTK信号通路

为了进一步表征未成熟肌腱和成熟肌腱之间的差异，亚群进一步聚类。未成熟的肌腱细胞簇（簇0）可以进一步细分为6个簇。亚簇0和1中的细胞表现出典型腱细胞基因的高表达，如Col1a1，Fmod，Lum和Tnmd。亚簇0也呈现出间充质祖标记物Cd9的高表达，因此被注释为Cd9亚群，也表达软骨细胞相关基因（如Sox9，Acan和Col2a1）。Cd9细胞主要参与对缺氧，ECM组织和软骨细胞肥大的反应。P7和P14肌腱中都存在Cd9簇。Cd9细胞主要富集于细胞周期停滞、干细胞分化、胚胎形态发生和发育成熟途径。还高表达早期腱细胞的代表性标志物Scx，Mkx和Tnc。亚簇2和亚簇3高度表达的间充质干细胞标记物，如Thy1（Cd90），Cd44和Ly6a（Sca-1）。亚簇2也高度表达肌腱标志物Nes，因此被指定为Nes TSPCs。亚簇3显示出内皮标志物（如Cd34和Pdgfra）的高表达，因此被注释为内皮簇。在未成熟的肌腱细胞中鉴定出一个具有Krt2，Krt10和Krt1高表达的上皮簇（亚簇4）和一个免疫细胞簇（亚簇5），具有高表达的巨噬细胞标志物Cd68和趋化因子CCL9。

Nes TSPC，Txnip和Cd9簇表现出最强的细胞通讯。其中，Nes TSPC和Txnip簇显示出最多的细胞间相互作用。相比之下，免疫和上皮细胞簇与其他簇的相互作用最弱，表明它们的环境支持作用。

中间的Cd9+Cd271+ TSPC群体通过RTK信号通路驱动未成熟肌腱过渡

拟时序分析显示肌腱的增殖和干细胞群在开端，而成熟的肌腱成纤维细胞2和肌腱成纤维细胞3簇的P14在轨迹末端。（这里又是最开始的单细胞数据）

对DEG进行了聚类分了五组。簇1中的基因从一开始就下降，主要是细胞分裂（Mki67，Top2a和Prc1）的调节和参与形态发生（Gal）的发育生长。簇2中的基因主要参与调节细胞分化（Thy1和Nes）和凋亡过程（Bax和Cav1），表现出沿伪时间轴逐渐下调。簇3和4基因最初上调，然后下调，分别与上皮到间充质的转变（Notch1，Foxa1和Fuz）和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）活性（Cybb，Mapk311，Ret和Dusp5）的激活有关。最后，簇5中的基因在成熟过程结束时达到峰值，参与ECM组织（Ctsk，Prg4和Thbs4），对缺氧的反应（Ang和Loxl2）以及对机械刺激的细胞反应（Dcn和Serpine2）。免疫荧光染色结果证实，PRG4和THBS4的表达从第7天增加到第14天。

将细胞分为三种不同的状态：早期，中期和晚期。中间过渡状态下Cd9Cd271簇的比例显著增加，在成熟后期状态下降低。TGF-β和RTK信号通路主要在中期和后期得到丰富。具体而言，与早期状态相比，FGF信号通路，血小板衍生生长因子（PDGF）信号通路和NGF通路在中间状态下富集。与中间阶段相比，只有胰岛素生长因子（IGF）信号通路在晚期得到增强。Tgfb2从早期到后期被下调。Pdgfra从中间阶段上调到晚期，而其配体Pdgfa表达降低。Ngf，Igf1和Fgfr1促进肌腱成熟。

NGF能有效促进肌腱成熟

在肌腱成熟期间激活了几种RTK家族生长因子信号通路。选择FGF，PDGF-AA，IGF1和NGF来验证它们在肌腱成熟过程中的作用。采用了组织外植体模型。首先检查了这些生长因子治疗组中肌腱相关基因的表达。qRT-PCR结果显示，Tnmd在所有生长因子处理组中的表达均增加。然而，只有NGF治疗组显示肌腱主TF Scx的表达显著增加，免疫荧光染色结果进一步验证了这一点。NGF治疗还上调了其他肌腱相关基因的表达，如Col1a1，Col3a1，Bgn和Dcn。主要在成熟腱细胞中表达的Prg4也显著上调。NGF组胶原纤维的平均直径及分布范围显著大于对照组。这些发现全面证明NGF信号传导可以有效促进肌腱成熟。

后面还有一部分就是实验验证了SHP2参与肌腱成熟期间NGF触发的信号的转导并在其中发挥不可或缺的作用。

总结

1. 系统地评估肌腱成熟的关键过渡阶段
2. 揭示肌腱成熟期间细胞组成
3. NGF 分泌性 Cd9+Cd271+ TSPC 介导关键性过渡阶段
4. NGF/SHP2 通路调节肌腱成熟