组织 EVs蛋白组+scRNA-seq联合揭示EVs在炎症中驱动骨髓中性粒细胞募集

文献信息

标题：Extracellular vesicles from lung tissue drive bone marrow neutrophil recruitment in inflammation 期刊：J Extracell Vesicles 日期：2022.5.20 DOI: https://doi.org/10.1002/jev2.12223 作者及单位：Yuxin Yin，北京大学健康科学中心基础医学科学学院系统生物医学研究所

细胞外囊泡(EVs)是一种单膜囊泡，在远距离的细胞间通信中发挥重要作用。EVs的研究主要通过细胞培养系统进行了探索，但目前尚不清楚生理EV如何在体内发挥稳态或病理功能。在这里，我们报道了肺EVs通过传递双链DNA(dsDNA)促进骨髓中中性粒细胞的趋化。

数据情况

• 肺组织的单细胞数据来自GEO数据库：GSE133747 provided scRNA-seq data of lung cells from human and mouse。使用了 这个数据集中的female mouse lung sample和所有human lung sample。分析：“Seurat” package (v 3.0)，数据整合The “FindIntegrationAnchors” function 和 the “IntegrateData” function。
• human and mouse lung EV proteins数据：LC–MS/MS data，过滤标准：
  • (1) the protein was simultaneously detectable in all samples (six samples for human and three samples for mouse);
  • (2) the average peak area of the protein was greater than a certain value
  • 最终有583 human proteins and 589 mouse proteins用于后续分析

数据主要分为免疫细胞与非免疫细胞两大群：

• In human lung clusters, monocytes, T cells, macrophages, NK cells, DCs, B cells and mast cells were designated as immune cells, whereas other types of cells were designated as non-immune cells.
• In mouse lung clusters, B cells, T cells, macrophages, monocytes, NK cells, neutrophils and DCs were designated as immune cells, whereas other types of cells were designated as non-immune cells

肺组织EVs蛋白与单细胞Cluster交集情况：identified as “Cluster Markers”, “Non-Cluster Markers” or “Not detected” (Supplementary Tables 1 and 2).

结果

1.肺组织EVs的分离与鉴定

使用透射电镜(TEM)观察到了正常肺组织中存在的各种EVs和MVEs

为了从正常肺组织中收集高质量的 EVs，我们开发并优化了一种基于差异离心的方案，如图所示：

在小鼠样本中，EVs相关蛋白(ALIX、TSG101、CD9、CD81)在110,000×g颗粒(P110kg)中高度富集，而高尔基体(GM130)、内质网(Calnexin)和线粒体蛋白(TOM20、VDAC1)在P110kg部分中检测不到或仅微弱存在。

EV标记蛋白在人类样本P110kg部分的类似富集。

透射电镜、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和低温电子断层扫描显示，人类和小鼠组织中P110kg部分中囊泡的形态和大小分布相似。

上面提到的几种实验都是鉴定样本中是否存在EVs的常用技术：透射电镜(TEM)，纳米颗粒跟踪分析(NTA)，Marker蛋白印迹法

2.人和小鼠肺EVs的蛋白质组学分析

采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析了从6个人和3个小鼠肺样本中分离的EVs蛋白成分。为了评估来自不同来源的蛋白质组之间的总体相关性，我们比较了不同类型的样本类型(即肺细胞与肺EVs)和物种(即人类EVs与小鼠EVs)。

• 与肺组织细胞相比，肺EVs显示出不同的蛋白谱：除了经典的EV标记物(CD9、CD81)外，还鉴定了肺特异性EV标记物(GPRC5A、AGER)
• 与EVs中的典型蛋白相比，在肺细胞中检测到位于细胞骨架(如TUBB、ACTN1和LCP1)和细胞质(如arhgdib、CNDP2和PGD)上的蛋白水平更高
• 人类和小鼠肺EVs的蛋白质组相似，检测到的超过一半的蛋白质是共享的

FIGURE2 Protein profiling proves vesicle- and tissue-specificity of lung EVs

3.GPRC5A和AGER被鉴定为肺EVs标记物，这也证实了分离的EV的组织来源

4.ATII是肺EVs的主要来源

多种哺乳动物细胞都能够释放EVs，而EVs的分子组成可以反映出它们的原始细胞，而scRNA-seq是一种解剖器官和组织复杂性的强大技术，有助于我们了解细胞多样性和异质性转录表型状态的基础。我们试图利用公共scRNA-seq数据和我们的LC-MS/MS结果来确定EVs的来源，遵循如图所示的过程：

简单地说，在获得了肺细胞的scRNA-seq数据和肺EVs的蛋白质组学数据后，我们评估了肺EVs的蛋白质组成是否能反映其细胞来源。

由于EVs中超过一半的蛋白质在特定的细胞类型中表达，我们根据每个细胞簇的丰度(来自LC-MS/MS数据)和表达水平(来自scRNA-seq数据)计算了每个细胞簇中EVs的比例。最后，我们计算了单细胞释放EVs的能力。

单细胞聚类结果：

来自17,370个人类细胞的15个界限明确的簇和来自3989个小鼠肺细胞的16个簇，包括在肺中发现的常见免疫细胞和非免疫细胞。

我们从人类（补充表1）中选择了583个高丰度EV蛋白，从小鼠（补充表2）中选择了589个，并生成了热图，显示编码EV蛋白的基因在不同的簇中具有不同的表达水平。

这些EVs蛋白在单细胞cluster gene中的情况：至少有一半以上都与细胞特异性高表达基因overlap，表明蛋白质在scRNA-seq数据中的一个或多个聚类中特异性表达。

这些结果表明，肺EVs中的蛋白质可以反映其细胞来源，这对后续的分析具有重要意义。

对scRNA-seq和LC-MS/MS数据的综合分析表明，ATIIs可以占大部分EVs，表明ATIIs是肺组织EVs的主要来源：

图中百分比计算方式：

然后使用蛋白质谱分析来评估单个细胞释放EVs的个体能力。对于人类样本，我们发现单个成纤维细胞释放的EVs最多(图3e)，而ATI细胞从小鼠样本中释放的EVs最多(图3f)。

与单个免疫细胞相比，从单个非免疫细胞中获得了更多的 EVs：

对多种人和小鼠细胞系培养上清液中 EVs的定量分析显示了相似的结果。

GSEA分析显示：与所有免疫细胞相比，所有非免疫细胞中EVs分泌相关基因均显著富集(图3j)。EVs分泌相关基因在非免疫细胞中的表达上调与它们释放EV的能力高于免疫细胞的能力相一致

上述结果表明，我们的分离和高通量检测方法已确定ATII细胞是肺EVs的主要来源，非免疫细胞通常比免疫细胞释放更多的ev（每个细胞）。

那确定了EVs的来源细胞，它的目的地在哪里呢（受体细胞）？

接下来的问题：搭载了EVs这个通讯工具的cargos(蛋白质)要运往何处？

EVs通过细胞和器官之间传递货物，导致受体细胞的改变。为了探索肺EVs的生物学功能，我们首先研究了它们的积累位置。

实验设计：

为了评估小鼠肺EVs在小鼠体内的生物分布，将DiR标记的肺EVs通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内；以DiR标记的脂质体作为对照。然后使用体内成像系统对这些动物进行检查。

结果：

• 我们发现，与注射脂质体的对照组小鼠相比，注射肺EVs的小鼠的下肢显示出高荧光信号
• 流式细胞术分析证实了这些结果，与对照组小鼠相比，在注射了DiI标记的EVs的小鼠骨髓中检测到更多的红色荧光
• 然后，我们研究了不同的给药途径对肺EVs分布的影响，即尾静脉注射、腹腔注射和鼻内灌注：结果表明，不同途径不影响肺EVs在骨髓的积累，与其他两种途径相比，骨髓中静脉注射检测到更多的红色荧光细胞，说明肺EVs通过血管转移，与预期一致
• 使用双光子激光扫描显微镜对小鼠肺组织进行活体成像，我们还在鼻内灌注dii标记的EVs 24小时后，在血管内空间观察到红色荧光标记的EVs(补充图5a)，支持了肺EVs进入血管的结论。
• 骨髓中的红色荧光细胞随后被鉴定为主要为中性粒细胞（52.7%）和单核细胞（24.1%）

• 利用共聚焦显微镜，我们观察到用红色荧光标记的肺EVs与中性粒细胞共定位，这些中性粒细胞被鉴定为CD45+Ly6G+细胞（Ly6G - a marker for monocytes, granulocytes and neutrophils：https://www.novusbio.com/antibody-news/antibodies/ly6g-a-marker-for-monocytes-granulocytes-and-neutrophils）
• 此外，作者还进行了体内实验验证肺EVs可以转移到骨髓中性粒细胞(下图F)

以上结果表明，肺EVs转移到骨髓中性粒细胞是通过血管发生的

EVs通讯的几大关键问题与挑战不知大家还记得与否：外泌体多组学05-EV介导的细胞间通讯研究综述

第一个非常重要的是：来源细胞与受体细胞的确定，此篇文章做了很多研究工作，结合了组织外泌体与单细胞技术完美揭示这个问题！

第二个问题：EVs被运到受体细胞后，会对受体细胞产生什么样的影响呢？（比如进入受体细胞的通路机制，在受体细胞内发挥作用的通路机制）

实验设计：

mRNA sequencing analysis：肺EVs刺激的中性粒细胞 vs untreated 中性粒细胞

结果：

• 差异分析与GSEA：相对于对照组，促炎趋化因子的转录水平在肺EVs刺激的中性粒细胞显著上调

这表明：肺EVs可促进中性粒细胞趋化

根据作者强大的生物背景知识：已知CXCL1和CXCL2有助于急性炎症过程中中性粒细胞动员和招募的早期阶段。

作者前面还对肺EVs做了一个全基因组测序，并将EVs中的 dsDNA引入了 EVs在受体细胞内发挥作用的通路机制解释中（我并不关注EVs中DNA层面的分析，感兴趣的可以去文章看详细内容），最后的通路机制如下：

我在此有个很大的疑问啊：所以EVs中的货物蛋白质在这里只是做了一个溯源？它对受体细胞就没有影响吗？即使作者说了EV衍生的DNA可以通过旁分泌的相互作用来调节肿瘤免疫。