胃腺癌肿瘤微环境免疫细胞分析

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题目：Single-cell profiling of infiltrating B cells and tertiary lymphoid structures in the TME of gastric adenocarcinomas 日期：2021-09-06 期刊：OncoImmunology DOI：https://doi.org/10.1080/2162402X.2021.1969767

摘要

胃癌是世界上最常见的五种肿瘤之一，也是全球第三大致命癌症。胃腺癌 (gADC) 的生长、侵袭和转移是复杂的动态过程，不仅涉及肿瘤组织固有的遗传异常，还涉及肿瘤与免疫细胞在肿瘤微环境（TME）中的相互作用。

肿瘤浸润性 B 细胞 (TIB) 存在于黑色素瘤、肉瘤和肾癌等肿瘤组织中，是三级淋巴结构 (TLS) 的主要成分。在慢性炎症和肿瘤发生过程中，TLS 是在非淋巴组织中形成的异位淋巴器官，由 T 细胞、B 细胞、滤泡树突状细胞、树突状细胞和其他细胞组成。TIBs 和 TLSs 在肿瘤中的具体作用和机制仍未完全了解。

非恶性和肿瘤 gADC 样本的细胞分群

从四名 gADC 患者中总共获得了 49,765 个单细胞。这些样本是非转移性的，来源于手术切除。其中，4,538 个单细胞来自癌旁组织，38,182 个来自癌组织，7,045 个单细胞来自 PBMC。

聚类分群得到29个clusters，然后进行注释：NK/T 细胞（NKG7、CD3E）、B 细胞（J-chain、CD79A）、单核细胞和巨噬细胞（Mono/Mac）（CD14）、上皮细胞（KRT18） 、成纤维细胞 (DCN)、内皮细胞 (ENG) 和 CMP 细胞 (TPSAB1) 。

看到gADC组织中有大量B细胞存在TLSs，提示B细胞可能在TLSs的形成中起重要作用。

gADC 中 B 细胞亚群

将17, 302 个B细胞继续细分成 21 个cluster：

• sub-cluster 1, 2, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 16, 17, and 21 were defined as plasma cells (express Ig-related genes)
• sub-cluster 3, 15 were defined as mucosal associated lymphoid tissue (MALT) derived B cells (express J-chain and Ig)
• sub-cluster 8 was defined as naive B cells (express CD19, CD24, and CD38)
• sub-cluster 10 was defined as follicular B cells (express MS4A1, CD74, and HLA-DRA)
• subcluster 11, 18, and 19 were defined memory B cells (express HMGN2 and H2AFZ)
• sub-clusters 4 (CL4) was defined as inflammation-associated B cells (express FTH1, TYROBP, and FCER1G)
• subcluster 5 (CL5) was defined as tumor-associated B cells (express AGR2, MT1G, and TSPAN8)

CL4 和 CL5 也存在于含有 mTLS 的 gADC 组织中，而 Naive B 细胞主要存在于 PBMCs 组织中

富集分析发现 MALT-B 细胞的主要功能可能与补体激活信号通路、免疫反应和 B 细胞激活有关，表明 B 细胞介导的补体激活信号通路在 TLS 中发挥着不可替代的作用。

之后使用monocle进行了拟时序分析，发现从root 4 开始，B 细胞分为naive B 细胞/记忆 B 细胞和浆细胞然后分支成两个末端分支：MALT-B 细胞和炎症/肿瘤相关 B 细胞。还发现了两种类型的记忆 B 细胞状态节点，一种来自幼稚 B 细胞，另一种是可用作分化为浆细胞的节点。

gADC 中 T细胞亚群

16, 233 个 T 细胞重新聚类为13个cluster：

• sub-cluster 1 was activated T cells (express CD69),
• sub-cluster 2 and 7 were Naive T cells (express SELL, CCR7, and LEF1),
• sub-cluster 3 was regulatory T (Treg) cells (express FOXP3 and ICOS),
• sub-cluster 4 was CL4 (express IGH),
• sub-cluster 5 was proliferative T cells (express CCNB2, DLGAP5, and MKI67)
• sub-clusters 6 and 11 were cytotoxic CD8 + T (CTL) cells (CD8+ and express NKG7, GZMA, and GNLY),
• sub-cluster 8 was Natural killer T (NKT) cells (CD8+ and express NKG7, GZMA, and KLRD1),
• sub-cluster 9 (CL9) was undefined
• sub-clusters 10 and 13 were natural killer (NK) cells (CD8-, but express NKG7, GZMA),
• sub-cluster 12 was exhausted CD4 + T cells (CD4+, but express PDCD1 and CXCL13),

为了确定每个样本的免疫状态，将 5ʹRACE 技术和 scRNA 测序相结合，分析了 gADC 患者肿瘤组织、癌旁组织和外周血中的 T 细胞受体 (TCR) 文库。比较独特的克隆类型（图d 1）、丰度（图d 2）和克隆频率的比例（图d 3）发现，肿瘤组织的TCR多样性高于邻近正常组织和外周血。

进一步比较了来自不同 T 亚群的 TCR 扩增，表明大量克隆型扩增发生在与 CD4 +耗竭相关的 NKT 和 CTL 细胞中，因此这些 NKT 和 CTL 细胞可能在肿瘤免疫中发挥更重要的作用。

gADC 中 Mono/Mac 亚群

8,682 个 Mono/Mac 被分成12个cluster：

• 1、4、5 和 7 被定义为 Mono/Mac-1 细胞（表达 CD14、IFTM3、C1QC 和 C1QB）；
• 3、10 和 12 被定义为 Mono/Mac-2 细胞（表达 CD14、S100A8、FCN1 和 S100A9）；
• 9 被定义为 Mono/Mac-3 细胞（表达 CD14 和 LGMN）；
• 6 被定义为 Mono/Mac-T 细胞（表达 CD14、与炎症反应相关的基因和 T 细胞生物标志物）；
• 8 被定义为树突状细胞（DC）（表达 CD1C）；
• 2 和 11 未定义

Mono/Mac-2 细胞是 PBMC 和非恶性组织样本中的主要亚群，而肿瘤组织中 Mono/Mac 细胞的种类更为丰富

GSVA结果显示，与非恶性胃组织样本相比，肿瘤来源的细胞富集在许多通路，例如上皮-间质转化（EMT）、Myc信号通路。

Mono/Mac-2主要存在于良性样本中，而Mono/Mac-1和-3主要存在于恶性组织样本中。

恶性和非恶性上皮细胞的分类

5,036 个上皮细胞继续分为9个cluster，其中1、2、5、6、8 和 9 主要存在于肿瘤样本中。

肿瘤细胞易发生 CNV 突变，与正常细胞相比，发生 CNV 变化区域的基因总是表现为过表达或下调。这里选择了先前定义为上皮细胞的细胞群，并根据InferCNV的表达矩阵推断恶性细胞和非恶性细胞。

用“KRT14”、“KRT17”、“KRT6A”、“KRT5”、“KRT8”、“KRT18”、“KRT15”、“KRT6C”、“KRTCAP3”、“SFN”、“ EpCAM”等基因进行恶性肿瘤与癌旁组织之间的评分，发现两组之间差异显著。