单细胞专题 | 1.单细胞测序（10×genomics技术）的原理

最近有点闲下来了，给大家分享一下单细胞的笔记》

单细胞 RNA 测序（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种在单细胞水平上利用 RNA 测序对特细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术。待测组织经过单细胞分离、RNA 提取、逆转录、文库构建和测序，便可利用数据分析获得多个细胞的基因表达谱。

1.单细胞测序与普通转录组测序的区别

普通转录组使用细胞混合物组成的样品进行测序，因此只能估计基因在细胞群中的平均表达水平，没有考虑样本中各个细胞的基因表达的异质性。无法分析早期发育组织或复杂组织的异质系统（如大脑组织等）。为克服这一限制，开发了单细胞水平的转录组测序技术（scRNA-seq）。

2.单细胞测序的原理

前面也介绍过，单细胞测序技术原理。这里做个补充。

单细胞测序技术以单个细胞作为对象，通过对单个细胞遗传物质均匀扩增，标记建库后进行测序，最后对单个细胞基因组或转录组展开数据分析，其技术原理主要包括单细胞分离、扩增测序和数据分析3方面。

单细胞分离：主要包括荧光激活细胞分选法( flow- activated cell sorting ，FACS) 以及微流控分选法( microfluidics) 等。市场上，较成熟的商业单细胞测序公司主要有 10X Genomis 公司 的Chromium( 液滴法) 及 BD 公司的Ｒhapsody( 微孔法)。

这里重点介绍 10×genomics技术。

首先在凝胶微珠上种上特定的DNA片段，DNA片段由三部分组成：Barcode、UMI、PolyT组成。Barcode是16个碱基的长度。一共有400万种Barcode，一个微珠是对应于一种Barcode，通过这400万种Barcode，可以把凝胶微珠给区分开。UMI是一段随机序列，也就是说每一个DNA分子，都有自己的UMI序列。10个碱基长的UMI，有100万种序列的变化（4^10 = 1,048,576），UMI的作用是为了区分哪些哪些reads是来自于一个原始cDNA分子，区分基因片段重复还是duplication及区分是真实的SNP位点还是PCR产生的突变。

3' 端文库的构建

通过10×genomics仪器将单个细胞与单个凝胶微珠通过油相混在一起，形成油包水的小微滴，接下来把细胞膜破掉，让细胞当中的mRNA游离出来。游离出来的mRNA与小液滴中的水相混合，也就是和逆转录酶、结合在凝胶微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接触。接着，发生逆转录反应。mRNA与凝胶微珠上带标签的DNA分子相结合，在逆转录酶的作用下，逆转录出cDNA来。

把这个乳浊液当中所有的水相抽出来，也就是把所有带了标签的cDNA分子都抽出来，再把这些cDNA分子都加上接头，经过PCR扩增，做成illumina的测序文库，放到Illumina的测序仪上进行测序。

5' 端文库的构建

与3’端文库的构建过程相似

小提示：barcode和UMI是单细胞中常见的名词，barcode就像是每个凝胶微珠的身份证号码；而UMI则像是每个DNA标签分子的身份证号码。

scRNA-seq 非常适合研究细胞群的异质性。例如，识别组织的细胞类型，定义不同细胞类型的"转录指纹"，研究细胞分化，探索疾病或环境因素导致的细胞组成变化等。

单细胞测序的经典流程：分离单细胞（核），将RNA转换为cDNA，准备测序文库（illumina）后测序。

SMART-seq2是一种低通量单细胞测序法，提供全长转录组的定量，适合研究小细胞组（如差异isoform使用，低表达转录本的特征）。

10x Chromium是一种高通量方法，使用UMIs进行定量，适合研究高度异质组织和大量的细胞样本。

后面介绍数据怎么分析............