单细胞专题 | 3.单细胞转录组的上游分析-从BCL到FASTQ

单细胞专题 | 1.单细胞测序（10×genomics技术）的原理

单细胞专题 | 2.如何开始单细胞RNASeq数据分析

(1) 软件安装和介绍

Cellranger mkfastq 管道可用于将 BCL 文件解码为单个库的 FASTQ 文件。如果测序提供程序已经完成了这一步，则可以直接使用每个库的 FASTQ 文件进行数据分析。cellranger mkfastq的本质是调用bcl2fastq生成bcl2fastq，并生成额外的10x样本信息。Bcl2fastq是 illumina开发的bcl到fastq的转换程序。cellranger下载安装地址如下：

https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest?

安装cellranger

#解压下载的软件
# https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_in
tar -xzf cellranger-6.1.2.tar.gz

#配置环境变量，注意解压后的文件路径
echo 'export PATH=~/softwares/cellranger-6.1.2:$PATH' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc

cellranger testrun --id=tiny

在conda环境中安装bcl2fastq，因为Cellranger依赖于bcl2fastq。

#https://anaconda.org/dranew/bcl2fastq
conda install -c dranew bcl2fastq

(2) 案例

公司提供的bcl原始测序文件，本次教学使用使用cellranger的测试数据

curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/cellranger-tiny-bcl-1.2.0.tar.gz
curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv

tar -zxvf cellranger-tiny-bcl-1.2.0.tar.gz
tree -L 2 cellranger-tiny-bcl-1.2.0/

您的数据可能看起来有点不同，这取决于测序仪器使用。查看目录的前几个级别是检查完整性的好方法。如果您没有看到 RTAComplete.txt、 RunInfo.xml 和 runParameters.xml 文件，那么管道很可能会失败。如果缺少任何这些文件，请与您的测序提供程序联系，并要求获得完整的运行目录。

cat cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv

• Lane：要处理flowcell的那个通道。可以是单个泳道（1）、范围（例如 2-4）或flowcell中所有泳道（*）。 • Sample：样本名称。所有生成的 FASTQ 表头前缀，对应于所有下游 10x 管道中的 --sample 参数。样本名称只允许使用字母、数字、下划线_和-；不允许使用其他符号，包括点（“.” ）。 • Index：用于文库构建的 10x 样本索引，例如 SI-TT-D9 或 SI-GA-A1。

查看帮助文档

cellranger mkfastq --help

Cellranger mkfastq 将 BCL 文件解码为单个库的 FASTQ 文件

cellranger mkfastq --id=tiny-bcl --run=cellranger-tiny-bcl-1.2.0 --csv=cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv

• --id：mkfastq命令输出FASTQ文件的文件夹名称

• --run：BCL（Base CALL）所在文件夹名称（该文件为illumina测序的下机文件）

• --csv：对应BCL文件的样本信息表，用于描述如何在 Illumina flow 单元上对样本进行索引。

查看输入：tree -L 2 tiny-bcl/

运行时间根据系统资源的不同而不同，但是它不应该占用多于几分钟的时间。现在转到 fastq _ path 目录。

 cd tiny-bcl/outs/fastq_path/

具有有效排序索引的Demultiplexed FASTQ 文件可以在以 flow cell id 命名的目录下找到，在本例中为 H35KCBCXY。

这些来自 cellranger mkfastq 管道的输出作为 cellranger count的输入。我们后续介绍。