单细胞专题 | 1.单细胞测序(10×genomics技术)的原理
(1) 软件安装和介绍
Cellranger mkfastq 管道可用于将 BCL 文件解码为单个库的 FASTQ 文件。如果测序提供程序已经完成了这一步,则可以直接使用每个库的 FASTQ 文件进行数据分析。cellranger mkfastq的本质是调用bcl2fastq生成bcl2fastq,并生成额外的10x样本信息。Bcl2fastq是 illumina开发的bcl到fastq的转换程序。cellranger下载安装地址如下:
https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest?
安装cellranger
#解压下载的软件
# https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_in
tar -xzf cellranger-6.1.2.tar.gz
#配置环境变量,注意解压后的文件路径
echo 'export PATH=~/softwares/cellranger-6.1.2:$PATH' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc
cellranger testrun --id=tiny
在conda环境中安装bcl2fastq,因为Cellranger依赖于bcl2fastq。
#https://anaconda.org/dranew/bcl2fastq
conda install -c dranew bcl2fastq
公司提供的bcl原始测序文件,本次教学使用使用cellranger的测试数据
curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/cellranger-tiny-bcl-1.2.0.tar.gz
curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv
tar -zxvf cellranger-tiny-bcl-1.2.0.tar.gz
tree -L 2 cellranger-tiny-bcl-1.2.0/
您的数据可能看起来有点不同,这取决于测序仪器使用。查看目录的前几个级别是检查完整性的好方法。如果您没有看到 RTAComplete.txt、 RunInfo.xml 和 runParameters.xml 文件,那么管道很可能会失败。如果缺少任何这些文件,请与您的测序提供程序联系,并要求获得完整的运行目录。
cat cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv
• Lane:要处理flowcell的那个通道。可以是单个泳道(1)、范围(例如 2-4)或flowcell中所有泳道(*)。 • Sample:样本名称。所有生成的 FASTQ 表头前缀,对应于所有下游 10x 管道中的 --sample 参数。样本名称只允许使用字母、数字、下划线_和-;不允许使用其他符号,包括点(“.” )。 • Index:用于文库构建的 10x 样本索引,例如 SI-TT-D9 或 SI-GA-A1。
查看帮助文档
cellranger mkfastq --help
Cellranger mkfastq 将 BCL 文件解码为单个库的 FASTQ 文件
cellranger mkfastq --id=tiny-bcl --run=cellranger-tiny-bcl-1.2.0 --csv=cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv
• --id:mkfastq命令输出FASTQ文件的文件夹名称
• --run:BCL(Base CALL)所在文件夹名称(该文件为illumina测序的下机文件)
• --csv:对应BCL文件的样本信息表,用于描述如何在 Illumina flow 单元上对样本进行索引。
查看输入:tree -L 2 tiny-bcl/
运行时间根据系统资源的不同而不同,但是它不应该占用多于几分钟的时间。现在转到 fastq _ path 目录。
cd tiny-bcl/outs/fastq_path/
具有有效排序索引的Demultiplexed FASTQ 文件可以在以 flow cell id 命名的目录下找到,在本例中为 H35KCBCXY。
这些来自 cellranger mkfastq
管道的输出作为 cellranger count
的输入。我们后续介绍。
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