ACS AMI：一种三管齐下的协同治疗来增强抗肿瘤作用

【研究背景】

据世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构(IARC)最新公布的2020年全球癌症负担数据显示，癌症仍然是全世界死亡的主要原因。现代纳米技术、光学、生物学和医学的结合提供了抗击癌症的新方法。虽然多模式治疗对肿瘤细胞有杀伤作用，但由于肿瘤微环境(TME)固有的生理屏障，如缺氧、过氧化氢(H2O2)和谷胱甘肽(GSH)过表达等，其疗效仍受到限制。

【成果介绍】

为此，湖北大学徐祖顺教授团队基于前期研究的见解，采用一种温和的方法制备了纳米级GBD-Fe，该纳米粒子可用于MRI监测和预后评估，在TME中提供选择性反应，并将诊断和化学动力治疗/化疗/光热治疗(CDT/CT/PTT)治疗相结合。这种三管齐下的治疗机制可以通过互补结合的方式解决疗效问题。首先，Fe3+引导的CDT由自身消耗的GSH启动。第二，CT上调NOX4表达，促进H2O2生成，增强CDT作用。第三，DOX下调Bcl-2表达，降低GSH水平，进一步消除CDT耐药性。第四，PTT产生的热量可以改变细胞膜的通透性，从而增加肿瘤对CT的敏感性，增强CT的效果。需要指出的是，将磁共振成像（MRI）与治疗相结合，可提供有效的治疗和良好的预后，实时监测治疗进展。

首先，该团队采用无种子法成功合成了光热剂金纳米棒(GNRs)，并引入牛血清白蛋白(BSA)作为桥接剂，使其能够有效地负载DOX与Fe3+的络合物(DOX-Fe3+)，从而得到形貌为规则球形的纳米级GBD-Fe。（图1）

接着，对GBD-Fe的光热特性，热稳定性及类芬顿活性进行了验证，这为纳米粒子在细胞和体内的进一步应用奠定了基础。（图2）

紧接着，进行GBD-Fe的相关细胞试验。在细胞摄取实验中，GBD-Fe在细胞中积累的荧光随时间增加，表明细胞对GBD-Fe的摄取有时间依赖性。由细胞毒性试验可知，多因素治疗效果明显优于单因素治疗效果。同样地，在验证GBD-Fe的ROS生成实验中，经多因素治疗的细胞中有更强的ROS生成能力。细胞的活死染实验可以直观地看出GBD-Fe的多因素治疗对癌细胞有更大的杀伤作用。细胞凋亡实验进一步证明了GBD-Fe的三管齐下协同治疗机制可以有效增强抗肿瘤作用。免疫蛋白印迹实验明确了GBD-Fe对肿瘤细胞蛋白的调节作用。（图3-4）

然后，体内MRI实验表明GBD-Fe是一种优秀的MRI造影剂，循环24h后可在肿瘤处有效积累，为后续的体内治疗提供指导和预后评估。（图5）

最后，体内动物实验表明，通过尾静脉注射给药，GBD-Fe经血液循环后能有效在肿瘤组织中累积。与设计预期一致，所有结果表明GBD-Fe的三管齐下协同治疗机制可以通过互补结合的方式有效地诱导肿瘤细胞毒性，抑制肿瘤生长。因此，我们认为GBD-Fe代表了一种潜在的肿瘤治疗策略，将为肿瘤的多因素协同治疗提供一个新的视角。（图6）

原理图 GBD-Fe合成方案及互补治疗原理图

图1 (A) GNRs和 (B) GBD-Fe的透射电镜图像。GNRs、GNR@BSA、DOX Fe和GBD-Fe的 (C) 紫外可见光谱(归一化)和 (D) zeta电位。(E) GBD-Fe的Fe2p XPS光谱(a.u.; arbitrary units)。(F) GBD-Fe在细胞培养基中孵育10天的大小分布分析。(G)pH为5.5和7.4时，GBD-Fe中DOX-Fe3+的释放曲线。(H)GSH和GSSG的FT-IR谱图。(I) 在Fe3+是否存在时1,10-邻菲咯啉的紫外可见光谱图(归一化)。

图2 (A) 在NIR激光辐照下GBD-Fe的IR图像。(B) GBD-Fe的热循环曲线。(C) GBD-Fe热循环前后的紫外吸收曲线(归一化)。(D)基质在不同条件下的过氧化情况。(E)GBD-Fe浓度对TMB过氧化作用的影响。(F)当pH 4.0、5.5、6.5和7.4时GBD-Fe与TA反应产生高荧光HA。(G) GBD-Fe在pH值为4.0、5.5和7.4时H2O2的消耗。(H) DTNB与GSH (0、25、37.5、50、62.5、75、87.5 μM)反应。(I)在反应24 h后GBD-Fe对GSH (0、20、40、60、80和100 μg/mL)的消耗。

图3。(A)在2、4或6 H时4T1细胞对GBD-Fe的摄取情况。Scale bar, 20 μm. (B)不同处理组产生的ROS荧光图像。Scalebar, 50 μm. (C) 808 nm激光处理和(D)不处理时4T1细胞的存活率。(E) PBS、Laser、B-Fe3+、GBD、GBD + Laser、GBD- Fe、GBD-Fe + Laser处理后4T1细胞的双染荧光图像。Scale bar, 200 μm.

图4 (A) 4T1细胞与PBS、GBD-Fe和GBD-Fe + Laser处理6 h后的凋亡水平。 (B) 免疫印迹检测 4T1细胞分别被PBS,DOX, DOX−Fe和GBD-Fe共孵育24 h后NOX4, BID和Bcl-2蛋白的表达水平。通过免疫印迹结果定量分析 (C)NOX4，(D)BID和 (E)Bcl-2的表达水平。* p< 0.05, ** p < 0.01，和***p < 0.001。(F)纳米制剂诱导4T1细胞死亡的凋亡机制。

图5 (A)不同Fe3+浓度的GBD-Fe在不同条件下体外MRI。(B)携带4T1细胞的小鼠体内T1加权MR图像和(C)在预定时间点的相对信号强度。** p< 0.01; *** p < 0.001。

图6 (A) 给药后48 h内GBD-Fe的血液循环曲线和 (B) 给药后24和48 h GBD-Fe在4只T1荷瘤小鼠体内的生物分布。(C) GBD-Fe处理的4T1荷瘤小鼠注射后不同时间点的NIR激光照射引起的温度变化。(D)GBD-Fe + Laser治疗小鼠在预定时间点的IR图像。(E) 取出PBS、GBD、GBD- Fe、GBD- Fe + Laser治疗14天后的肿瘤组织进行比较。(F) 治疗14天后肿瘤组织的最终重量。** p <0.01;*** p < 0.001。(G) 不同治疗后肿瘤体积随时间的变化。*** p < 0.001。(H) 14天治疗期间相对体重的变化。(I) 各种治疗后60 d生存率(N = 5 females/group)。(J) H&E和TUNEL染色后肿瘤组织的组织病理学评价。Scale bar, 200 μm.

综上所示，以GNRs为光热剂(BSA改性)，DOX-Fe3+络合物为CT和CDT的结构域，合成了纳米级GBD-Fe。GBD-Fe具有MR显像和联合治疗功能，可实现诊断与治疗的一体化。纳米制剂在TME中积累，DOX-Fe3+的络合保护了Fe3+免受氧化应激，防止药物过早释放，优化治疗活性。化疗药物DOX诱导NOX4蛋白表达产生H2O2，并与Fe3+发生氧化还原反应，增强CDT的作用，改善GNRs的光热性能。这种CT/CDT/PTT三管齐下的方法有效地诱导了肿瘤细胞的细胞毒性，抑制了荷瘤小鼠的肿瘤生长，因此，GBD-Fe的互补性治疗代表了一种潜在的肿瘤治疗策略，在诊疗一体化方面具有良好的应用前景。

湖北大学博士生莫智敏、华中科技大学同济医学院博士生李秋婷为论文共同第一作者，徐祖顺教授（湖北大学）、汪晶教授（华中科技大学同济医学院）、廖光福教授（中国地质大学（武汉））和杨盛力教授（华中科技大学同济医学院）为该文章的共同通讯作者。

【作者简介】

徐祖顺，博士生导师、教授，主要从事功能性聚合物乳液、聚合物纳米微球、树状大分子、嵌段及接枝共聚物、耐高温高分子材料、生物医用材料、环境友好型胶粘剂、涂料、微波辐射分散聚合、微球自组装等方面的研究工作。

廖光福，研究员/教授，于2020年6月获得中山大学材料物理与化学专业的博士学位。之后于香港中文大学机械与自动化工程系从事副研究员，于2021年8月在中国地质大学担任研究员职位。他的研究主要包括聚合物合成与应用、氧化还原流电池、纳米结构材料、光电催化、生物材料、气体储存和能量转换等。至今已经在Progressin Materials Science、Energy & Environmental Science、Trends in Chemistry、ACS Catalysis、Nano Energy、Macromolecules、Small、Journal of Materials ChemistryA、Journalof Catalysis、ChemicalEngineering Journal、Nano Reseach 等国际著名刊物发表 SCI 论文50余篇，授权专利 10 篇。论文引用 1827次，H-index24。并长期担任ACSNano、Macromolecules、Applied Catalysis B:Environmental、ACSApplied Materials & Interfaces、Chemical Engineering Journal、The Journal of PhysicalChemistry C等国际著名期刊审稿人。具体可参照以下链接http://hmyang.cug.edu.cn/index/index/details/?id=247或者http://orcid.org/0000-0003-1299-8106。

【文章信息】

Mo Z., Li Q., Zhao K.et al. ANanoarchitectonic Approach Enables Triple Modal Synergistic Therapies ToEnhance Antitumor Effects. ACS Applied Materials & Interfaces,2022. https://doi.org/10.1021/acsami.1c20416