中科大刘扬中教授、程珺洁副研究员和中科大附属第一医院沈爱宗主任《small》：基于铁蛋白的自产氧光动力体系用于肿瘤治疗

光动力疗法（PDT）是治疗肿瘤的一种有效策略，具有良好的时空精准性与可控性。通常PDT需要光敏剂、并在光照下消耗氧气、产生细胞毒性的活性氧（ROS）用于肿瘤治疗。O2分子在此过程中起着至关重要的作用，然而肿瘤乏氧是肿瘤微环境（TME）特征。为克服TME缺氧限制对PDT的限制。

示意图：Ce6/Ftn@MnO2纳米体系功能

中科大刘扬中教授、程珺洁副研究员和中科大附属第一医院沈爱宗主任在《small》期刊上发表了题目为“OxygenSelf-Supply Engineering-Ferritin for the Relief of Hypoxia in Tumors and theEnhancement of Photodynamic Therapy Efficacy”的文章。（doi/10.1002/smll.202200116）。为提高光动力治疗功效，该课题组设计一种了自产氧的PDT体系。一、以人源铁蛋白为载体，负载光动力试剂二氢卟酚e6（Ce6）和MnO2核；二、利用高含量H2O2和酸性的TME环境，将MnO2转化为Mn2+离子和O2，制备了可在肿瘤乏氧微环境中应用的PDT纳米制剂（Ce6/Ftn@MnO2）；三、反应释放的Mn2+离子具有磁共振成像增强作用。

图1 （a）材料合成示意图；（b）动态光散射测定材料的水合粒径；（c）铁蛋白的透射电镜；（d）材料的透射电镜图；（e）XPS分析材料中Mn的价态；（f）MnO2的降解实验；（g）材料的产氧实验；（h）硫酸钛检测过氧化氢分解；（i）DPBF检测单线态氧的产生；（j）电子顺磁共振检测单线态氧的效率。

在这项工作中，研究者通过原位生物矿化的方法在铁蛋白中载入MnO2，将经典的PDT分子Ce6加载到Ftn的空腔中，制备了Ce6/Ftn@MnO2纳米体系。该纳米体系可催化肿瘤细胞内源H2O2原位分解产生的O2，从而提高乏氧肿瘤微环境的PDT疗效。由于Ftn和MnO2的固有特性，所获得的Ce6/Ftn@MnO2具有良好的生物降解性、优异的生物相容性和高肿瘤积累性。

透射电子显微镜(TEM)图像验证Ce6/Ftn@MnO2的球形与尺寸，动态光散射显示负载药物后水合直径从12.8 nm增加到15.5 nm，并具有高稳定性。O2浓度实时评估显示MnO2在弱酸性条件下产生氧气，Ti(SO4)2测定验证H2O2分解。结合TEMP捕获，ESR谱验证Ce6/Ftn@MnO2在660nm激光照射下所产生的1O2明显高于自由Ce6。

图2 Ce6/Ftn@MnO2的体外PDT作用；（a）材料对细胞的暗毒性；（b）材料对细胞的光毒性；（c）材料在常氧和乏氧条件下的暗毒性；（d）死活细胞染色实验评价材料的抗肿瘤效果；（e）活性氧产生实验；（f）线粒体膜电位极化实验；（g）吖啶橙分析溶酶体膜的完整性。

共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检测表明Ce6/Ftn@MnO2在小鼠乳腺癌细胞中的摄取模型高于自由Ce6，O2探针评估Ce6/Ftn@MnO2在细胞内产生更多的氧气，抑制乏氧因子HIF-1α的表达，可以改善乏氧肿瘤的光动力治疗效果。MTT实验验证，Ce6/Ftn@MnO2本身毒性很低，而在660 nm激光照射下，在常氧和缺氧条件下都能有效地抑制细胞生长。ROS探针通过PDT在细胞中产生1O2，而低氧大大降低了自由Ce6的ROS生成效率。JC-1检测线粒体膜电位显示，Ce6/Ftn@MnO2产生的ROS诱导可以破坏线粒体膜。吖啶检测表明，溶酶体膜也同时被破坏，激光照射可进一步加重溶酶体膜的损伤。

图3. （a）Ce6/MnO2@Ftn的体内生物成像；（b）小鼠的肿瘤照片；（c）小鼠的肿瘤体积生长曲线；（d）小鼠肿瘤的质量；（e）小鼠的体重变化曲线；（f）免疫荧光检测小鼠肿瘤的血管和（g）乏氧；（h）image j拟合相对荧光数值；（i）不同实验组的H&E染色；（j）不同实验组的Ki67染色.

小鼠体内的抗肿瘤治疗实验显示，激光照射下Ce6/Ftn@MnO2具有明显的肿瘤抑制作用，这是由于MnO2减少了肿瘤乏氧环境，从而增强了PDT疗效。无光照或游离Ce6的光照没有显示出明显的生长抑制。免疫荧光评估肿瘤中HIF-1α表明，Ce6/Ftn@MnO2可以在肿瘤区域供氧以减少肿瘤乏氧，而对肿瘤部位周围血管的影响可以忽略不计。H＆E和Ki-67免疫染色证实，Ce6/Ftn@MnO2对肿瘤组织具有明显的杀伤作用，而其他正常组织没有明显影响，表明Ce6/Ftn@MnO2具有良好的生物相容性。生化指标分析表明，Ce6/Ftn@MnO2没有明显的肝肾毒性。

由于Ce6具有荧光成像功能，而Ce6/Ftn@MnO2在酸性条件下所释放的锰离子导致磁共振弛豫率明显提高，并且在H2O2存在下进一步增强，达到6.58 mм-1s-1。因此，可以通过荧光和锰共振双模式成像实时精确跟踪Ce6/Ftn@MnO2的体内分布。荧光检测显示，经尾静脉给药后，Ce6/Ftn@MnO2在肿瘤区域的荧光随时间逐渐增大，注射6小时后达到最高。之后逐渐降低，24小时后，肿瘤中的荧光强度仍然相对较强。与之相比，自由Ce6在3h后富集在肿瘤组织中，6 h后减少，24h完全消失，显示自由Ce6的代谢较快。表明Ce6/Ftn@MnO2在肿瘤中具有更好的富集作用，可以克服了小分子光敏剂循环半衰期短、肿瘤滞留时间不足等缺点。9.4 T MRI成像显示，Ce6/Ftn@MnO2具有良好的成像增强功能。TME中弱酸性和H2O2的存在显着增强了Ce6/Ftn@MnO2中Mn2+离子的释放，使其具有肿瘤MRI成像增强作用。

图4 （a）、（b）Ce6/Ftn@MnO2在不同条件下的磁共振成像；（c）体内磁共振成像效果。

综上结果表明，基于铁蛋白设计的自产氧光动力诊疗体系Ce6/Ftn@MnO2具有克服肿瘤微环境乏氧作用实现有效的光动力治疗。所采用的人源铁蛋白具有稳定性高、粒径均匀、生物安全性高的特点，并具有内在的肿瘤靶向性的功能。因而，Ce6/Ftn@MnO2可以通过同时破坏肿瘤氧化还原环境和增强PDT效应来显着抑制肿瘤生长。此外，Ce6/Ftn@MnO2可以通过荧光和TME增强的MR成像进行跟踪，从而为精确的空间选择性肿瘤成像提供了优势。

论文第一作者为中国科学技术大学已经毕业的博士朱阳，论文通讯作者为中国科学技术大学技术大学刘扬中教授、程珺洁副研究员和中科大附属第一医院沈爱宗主任。

参考文献：Yang Zhu, Duo Jin,Manman Liu, Yi Dai, Li Li, Xinwei Zheng, Lulu Wang, Aizong Shen,* Jianing Yu,Sisi Wu, Yun Wu, Kai Zhong, Junjie Cheng,* Yangzhong Liu*. Oxygen Self-SupplyEngineering-Ferritin for the Relief of Hypoxia in Tumors and the Enhancement ofPhotodynamic Therapy Efficacy. Small, 2022, 2200116

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smll.202200116