单细胞文献分享-利用单细胞测序技术分析根韧皮部细胞图谱，揭示了初生韧皮部邻近细胞中常见的转录模式

这篇文章是2022年8月4日发表在Nature Plants上的一篇文章，讲的是选用单细胞组学的技术来解析韧皮部细胞的一个过程。

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文章链接：https://www.nature.com/articles/s41477-022-01178-y

研究团队是剑桥大学的Yrjö Helariutta教授。

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摘要

单细胞测序最近可以产生大量的根细胞图谱。然而，一些细胞类型是难以捉摸的，仍然没有被充分解释。因此作者使用二代单细胞方法，放大根转录组排序与特定的标记，选用了一种更加精细的分辨率图谱去解析韧皮部细胞。该数据集强调了原生植物筛分元件（PSE）相邻系的发育轨迹和基因调控网络的相似性，PSE去核是韧皮部生物学中的一个关键事件。作为早期pse相邻谱系的一个标志，我们已经确定了一组DNA结合的单指（DOF）转录因子PINEAPPLEs (PAPL)，它作用于韧皮部早期DOF (PEAR)基因的下游，对保证在向自养过渡时有适当的根部营养非常重要。该数据为更加清晰的了解韧皮部细胞在根发育中的过程，提供了更新的图谱去探究相关的内容。

研究背景

植物的器官起源于胚胎后的分生组织，确定细胞类型的转录程序是了解植物发育的位置线索的关键信息。然而，尽管在维管束植物中，韧皮部和径向生长的预模式很重要，但韧皮部的基因表达还没有得到很好的阐述。

在拟南芥初生根中，韧皮部由六个细胞组成，属于四种不同的细胞类型：中央的PSE外侧有两个韧皮部周围细胞（PPP），内侧有一个偏叶部筛元（MSE）细胞，两个SE细胞与两个侧向的伴生细胞（CC）直接接触（图1a）。

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在拟南芥根部，两种传导细胞（MSE和PSE）都来自同一个干细胞，但MSE分化较晚(Mähönen AP et al, 2000)。

Mähönen AP et al, 2000.png

尽管MSE具有与PSE相似的功能，但最近的一项研究强调，MSE的分化是独立于相邻或之前的PSE的分化，强调了这种细胞类型的特殊性(Graeff M et al, 2021)。

Graeff M et al, 2021.png

传导细胞类型和CCs起源于拟南芥根的不同的干细胞。CCs被认为是支持PSE去核功能的关键，它们之间的密切关系已经被一个共同的分子开关所证实，该开关控制着体外和下胚轴中SE/CC的命运，而在主根中，如果这些被错误地指定，未分化的CC和MSE可以转分化到PSE细胞。

Tamaki T et al, 2020.png

叶片中的CC功能包括将营养物质加载到SE中，但它们在根中的作用仍不清楚。通常人们认为它们参与韧皮部的卸载，即营养物质从筛管排出，从而到达分生组织细胞获取食物。然而，最近的研究表明，这一过程是通过连接PSE和PPP12的漏斗胞间连丝发生的(Helariutta Y et al, 2017)。

Helariutta Y et al, 2017.png

尽管PPP和相关的维管系统被认为是非维管组织，但它们在基因表达上有很高的相似性，并且在大小和超微结构上不同于木质部中的中柱细胞(XPP)群体，在早期阶段的出现特定基因表达，反映了拟南芥维管组织中的二原型模式(Parizot B et al, 2008)。

Parizot B et al, 2008.png

在过去的15年中，转录组学的发展促进了植物器官研究。然而，即使成熟的CC和PPP的标记被用于转录组学，由于缺乏早期韧皮部的特异性标记，阻碍了对这些细胞群的研究，这些细胞群经常被掩盖在将周缘和脉管系统组合在一起的 "茎 "的概念之下。最近的根部单细胞图谱提供了详细的根部全景图，但即使这样，对于韧皮部细胞的研究仍然不足。

因此作者通过对韧皮部标记基因进行分类，结合单细胞测序，产生了一个由10204个细胞组成的韧皮部细胞图谱。不仅获得了PSE系的图谱信息，而且还获得了韧皮部所有周围细胞（CC、PPP和MSE）的信息，所有这些细胞在一般根细胞图谱中的代表性都很低。作者不仅分析了每种细胞类型的特异性，而且还分析了它们之间的转录共性。作者还发现了第二个亚群中在PSE相邻细胞中表达的DOF转录因子（TF），在PEAR TF的下游，在幼苗向自体营养的过渡中非常重要。

科学问题

韧皮部细胞在根发育过程中扮演了什么样的角色？

结果

图谱的构建

为了描绘韧皮部细胞，作者利用了新的和现有的荧光标记，在早期分生组织细胞直到分化期间表达SEs, CC和PPP(图1a)。

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通过流式细胞仪可以丰富研究数据结果，并使用10X平台进行单细胞文库构建，获得10,204个高质量的细胞，定义为那些至少有2,000个检测到的基因，并将这些细胞划分为15个亚群。

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选用marker基因对细胞类型鉴定，将所有的细胞划分呈6种细胞类型。

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考虑到在PPP特异性簇中统计上更高表达的基因，作者建立了两个基因的报告系，这两个基因被证实具有PPP特异性表达。其中一种是AT3g27030，在PPP和晚期PSE中表达，而另一种是METHYL ESTERASE(MES7，At2g23560)，在PPP早期表达，不久之后在血管和内皮中表达更广泛。

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图谱中的时空发育轨迹

通过详细的细胞注释，可以描述韧皮部发育的细胞轨迹图谱。通常分化较多的基因在UMAP降维图中显示比较高的表达量。

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为了研究结果的准确性，作者使用显微切割根的数据集进行相关性验证。得到与本研究分析一样的结果，表明本研究的单细胞的数据的可靠性。

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为了探究细胞的轨迹发生，指定为第13簇中的所有细胞(循环细胞)设置唯一的起点，得到了5条不同的轨迹(图3A)，反映了已知的根发育轨迹。此外，这些轨迹与使用scVelo43进行的RNA速度分析一致，速度向量朝向这些轨迹的末端(扩展数据图2C)。

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确定了MSE发育的首要阶段

MSE很难识别，因为没有可用于该细胞类型的特定标记。然而，通过使用细胞分选减少样本中细胞的多样性，能够获得关于这一难以捉摸的细胞群体的一些见解。轨迹分析识别出主要由簇10(扩展数据图2B)形成的轨迹(轨迹4，图3A)，这主要是由MAKR5排序贡献的，表明这可能是早期的MSE细胞(图2A)。在第10簇中，我们发现表达MSE标记的细胞，如sAPL和APL，以及在MSE和其他细胞类型中表达但不在PSE中表达的其他基因(AT5G47920，PAPL1；图2B和7)

该图谱可代表连续的韧皮部发育轨迹

为了查看本研究的数据深度，选用其他几个研究报道的数据进行整合、过滤，并查看韧皮部细胞的分群结果，发现原始集群在综合数据中的相对位置与在我们的分析中相似。

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作者还想把根部的韧皮部与最近发表的包含478个血管细胞的叶子单细胞数据集进行比较。在拟南芥的叶子中（图5a），叶脉通常由多个筛子元件形成，通常由至少两个CC和一个韧皮部细胞包围。反过来，与CC相比，韧皮部细胞更不规则，细胞质密度低得多，经常与一个或多个CC接触，共享比其他界面多得多的连接。当根和叶的数据被整合并使用标记基因对聚类进行注释时（图5d），我们注意到PPP和韧皮部细胞混合在两个聚类中（图5b，c）。 第9簇是由CC形成的，它同时存在于叶脉和根部。然而，第6簇包含了被注释为成熟的根周细胞和来自叶子的韧皮部细胞的混合物，显示了两个数据集中标志性的PPP（图5e）、韧皮部基因（图5f）和XPP（图5g）的表达（关于我们如何评估第6簇中两个数据集的细胞的混合程度见方法）。 韧皮部叶的基因在韧皮部极点细胞图谱的第11和14群中表达，分别对应于周缘和PPP ，（图5f）。周缘组织存在于根和茎中，但不存在于叶中，韧皮部细胞存在于气生组织和根次生韧皮部，但不存在于主根中。尽管是不同的细胞类型，有不同的起源，但韧皮部和成熟的周缘部之间的转录重叠，再次表明了植物中细胞功能的位置信息的重要性，加强了PSE作为韧皮部组织者的作用。这些数据还表明，实质细胞在不同的器官中具有相似性，强调了它们与韧皮部的相关性

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韧皮部极细胞共享转录程序

为了确定在韧皮部表现出不同表达模式的基因组，使用'bigScale2'47中实现的算法从单细胞RNA-seq数据中建立了一个基因共表达网络，该算法使用专门为稀疏的单细胞数据定制的基因-基因相关指标。这导致了一个包含5,238个顶点（基因）和370,794条边（连接两个基因，如果它们的相关性高于0.9）的基因-基因网络。其中，大多数模块在所有的轨迹中都很广泛，具有不同的时间模式。

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PINEAPPLE在韧皮部发育早期表达

在模块1子模块中也将其表达扩展到不太成熟的簇中的基因中，发现了一个DOF转录因子，DOF1.5（COGWHEEL1，COG1）。这个基因和它的姐妹基因DOF2.3（CYCLING DOF 4，CDF4）在早期韧皮部细胞中表达。

虽然这两个基因在PSE周围形成一个环，DOF1.5（以后称为PINEAPPLE1，PAPL1）也在表皮中表达，DOF2.3（PAPL2）在柱状细胞中发现，向QC方向有更宽的域。当与三个单位的黄色荧光蛋白（3xYFP）融合时，用绿色荧光蛋白（GFP）融合构建体观察到的环形图案向原生质延伸了一层（扩展数据图7a），表明在这一层的表达较弱。

PAPL转录因子是自主地作用于细胞的。与MAKR5的翻译域一起，PAPL基因的表达域表明，在韧皮部的复杂表达模式从早期阶段就与之相关。在微阵列数据中，PAPL基因被预测为PEAR的下游，模块1中的其他基因也是如此。

PEAR转录因子移动到与PSE相邻的细胞，以控制边缘细胞的分裂和其他非细胞自主的转录程序。这一点可由标记物证明，如SAPL和At3g16330在广泛的PEAR过表达后成为异位表达，或SAPL在PSE质膜关闭时在PSE中表达。

由于PEAR基因是高度冗余的，我们还在梨的六倍体突变体梨sext33中引入了PAPL1载体，在那里观察到其通常的分生组织表达的损失。同时，使用'icals3m'工具关闭PSE质膜与邻近细胞类型的连接，改变了PAPL1的环状表达（图7e），过量表达PEAR1导致PAPL2的异位表达（图7f）。这些结果验证了PAPL基因是PEAR的下游，并表明PEAR是需要且足以在早期韧皮部表达PAPL基因的。

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PAPL蛋白将PEAR基因与根部生理学联系起来

接下来，我们决定检查PAPL基因是否在PEAR基因的下游，以控制皮层细胞的分裂。由于PAPL在pear1pear2双突变体中表达延迟，并且在早期韧皮部不存在，我们选择这种突变体作为背景，在WOODEN LEG（WOL）启动子下表达PAPL1。当诱导PAPL1表达时（20小时处理或直接在β雌二醇中发芽并生长5天），我们没有观察到与PEAR1过量表达类似的表型，根部2的周缘细胞分裂增加（扩展数据图8a-h）。当PAPL1在野生型（WT）背景下在茎部过表达时，也观察到类似的结果（扩展数据图8i-p）。这些观察结果表明，PAPL基因不控制PEARs下游的周缘细胞分裂。

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为了深入了解PAPL基因的功能，在检查了papl单一突变体没有表现出任何明显的根部表型后，我们产生了双突变体（papl1-1 papl2和papl1-2 papl2）。我们使用cdf2转移DNA（T-DNA）等位基因55（papl11papl2cdf2-1, 3papl）产生了一个三联突变体。在一些条件下，三突变体的根比野生型短（扩展数据图9a），但当幼苗在没有蔗糖的培养基中生长时，这种影响更为明显（图7g和扩展数据图9a,b）。在共聚焦成像中，被逮捕的幼苗的根部分生组织看起来更短且发育不良（扩展数据图9d）

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PAPL基因在这个阶段在蔗糖和非蔗糖条件下都有表达，显示出与在更成熟的幼苗中观察到的类似模式（扩展数据图10a）。其他韧皮部标记基因，如MAKR5、APL和环状基因SBT4.12，在3papl突变体背景中的表达与野生型相似，表明3papl在韧皮部发育方面没有缺陷（扩展数据图10b-d）。相反，MAKR5在pear1pear2突变体背景中表达延迟（扩展数据图10b），APL在pear sext33中表达高度减少，表明PAPL基因不履行与PEAR基因相同的作用。当植物在有或没有蔗糖的培养基中生长时，这些标记和SUC2的表达相似（扩展数据图10e-h）。

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为了更好地了解3papl的表型，我们对生长在蔗糖耗尽培养基中的幼苗的叶片和根部进行了代谢分析，涉及6个发育阶段（播种后2-7天，dps）（补充表5）。我们在叶子和根部分别鉴定了7种和5种代谢物，在至少一个时间点上，WT和突变体之间有明显的差异（根据对整个数据的线性混合模型拟合，错误发现率（FDR）小于5%；见方法和图8a）。这些代谢物之一是蔗糖，仅在根部有显著差异，在那里突变体开始时水平较低（第2和第3天），然后继续增加，在第7天实验结束时达到与WT相当的水平（图8b）。在果糖--蔗糖的一个组成部分--以及在较小的程度上在葡萄糖--形成蔗糖的另一个单糖--中观察到类似的模式，有更明显的点（图8b）。据描述，在胚根萌发时，拟南芥种子中储存的所有糖分都已被消耗。在发芽后48小时内（大约在播种后第3天），脂质和蛋白质储备被耗尽，幼苗需要转为自养生长56,57。这些数据表明，在幼苗过渡到自养生长后，PAPL基因可能很重要，促进糖分运输到根等汇组织。

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讨论

我们的文章展示了结合FACS和单细胞测序的组织特异性转录组学的力量，以研究在器官一般细胞图谱中代表不足的难以捉摸的细胞群。使用基于液滴的技术也使我们能够收集更多的细胞，并且比平板相关方法的分辨率更高。

韧皮部极细胞图谱允许对韧皮部有一个整体的了解。虽然PPP和CC有特定的基因，但这些细胞类型共享其发展轨迹的第一个阶段。 轨迹分析还揭示了CC和早期MSE之间的联系，为MSE发展的早期阶段提供了新的见解。不同细胞类型之间的共性通过基因调控网络分析得到验证，报告证实了PSE周围所有细胞的环状表达模式的相关性。

PSE的分化包括去核和依赖邻近细胞生存。以APL表达为标准，我们绘制了图谱中的去核点。虽然PSE在与非专业化细胞相邻的分生组织中组织了韧皮部，但PSE去核标志着相邻细胞分化的开始，并开启了PSE周围系的类似基因调控网络，正如许多基因在PSE去核后所显示的环状模式所证明的。

根周细胞和叶子中的韧皮部细胞之间的相似性表明，尽管韧皮部细胞存在于不同的器官中，具有不同的解剖结构，但具有共同的特征，并加强了PSE作为韧皮部组织者的地位。

PAPL基因可以调节韧皮部负荷、长距离运输或韧皮部功能，需要更多的研究来确定它们的确切作用。

总结

文章的思路还是比较简单的，但是我不太喜欢这类作者的写作风格，看的我很晕。

首先是通过选择新的和现有的荧光标记去标记韧皮部的基因，去做定向的流式分选，来构建了根的韧皮部细胞图谱，目的是因为在根发育中韧皮部细胞较少，已有的单细胞数据很少能捕获到这一种细胞类型。

前面通过了现已知的标记基因进行注释细胞类型，获得了相关的细胞类型结果，并对每个细胞类型进行阐述，这里也选用了另一组的显微切割的数据进行数据集的验证。同时为了解释自己研究的细胞类型是很少的，又引入了几套已发表的单细胞根的转录组的数据来进行整合分析，表明的细胞注释结果是正确的。我觉得我看的晕的主要原因是，作者在对每个细胞类型进行解释的时候放入了很多文献，然后文章基因号过多，我就看的很晕。

然后在单细胞文中的亮点就是轨迹发育图谱的构建，作者也构建了轨迹发育图谱，去探究什么基因在转换的时候是比较重要的。韧皮部细胞是来源于胚胎后发育的，因此叶子和根部中均存在韧皮部细胞，那相关的功能是什么，作者也用一套单细胞的数据集来进行分析，来表明韧皮部细胞在不同组织的功能是什么。

这时通过轨迹分析，发现了一类细胞在发育起始是十分重要的，因此对这部分的数据进行着重的分析。引入了试验，进行验证相关的结果。在后面文章的亮点我觉得是为了证明这个基因在幼苗的发育中扮演着重要的角色，引入突变体的表型鉴定，及代谢物的测定，表明这类基因的确影响物质的运输，使得源库的运输不平衡，影响植株的生物量。

这时我的主要感觉是大佬在讲故事的时候真是能将一个很小的问题放大化，然后精细到一个点上。生物学的知识都知道韧皮部细胞起到一个疏导运输的过程，其中肯定与糖代谢等生物学过程是相关的，但是作者选用的精细的单细胞图谱再次在另一个思维角度上证实了这个科学问题，所以这个文章后续还是有在细读好几遍的需要。

参考文献

Mähönen AP, Bonke M, Kauppinen L, Riikonen M, Benfey PN, Helariutta Y. A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes Dev. 2000 Dec 1;14(23):2938-43. doi: 10.1101/gad.189200. PMID: 11114883; PMCID: PMC317089.

Graeff M, Hardtke CS. Metaphloem development in the Arabidopsis root tip. Development. 2021 Sep 15;148(18):dev199766. doi: 10.1242/dev.199766. Epub 2021 Jul 21. PMID: 34224570.

Tamaki T, Oya S, Naito M, Ozawa Y, Furuya T, Saito M, Sato M, Wakazaki M, Toyooka K, Fukuda H, Helariutta Y, Kondo Y. VISUAL-CC system uncovers the role of GSK3 as an orchestrator of vascular cell type ratio in plants. Commun Biol. 2020 Apr 22;3(1):184. doi: 10.1038/s42003-020-0907-3. PMID: 32322004; PMCID: PMC7176705.

Ross-Elliott TJ, Jensen KH, Haaning KS, Wager BM, Knoblauch J, Howell AH, Mullendore DL, Monteith AG, Paultre D, Yan D, Otero S, Bourdon M, Sager R, Lee JY, Helariutta Y, Knoblauch M, Oparka KJ. Phloem unloading in Arabidopsis roots is convective and regulated by the phloem-pole pericycle. Elife. 2017 Feb 23;6:e24125. doi: 10.7554/eLife.24125. PMID: 28230527; PMCID: PMC5365319.

Parizot B, Laplaze L, Ricaud L, Boucheron-Dubuisson E, Bayle V, Bonke M, De Smet I, Poethig SR, Helariutta Y, Haseloff J, Chriqui D, Beeckman T, Nussaume L. Diarch symmetry of the vascular bundle in Arabidopsis root encompasses the pericycle and is reflected in distich lateral root initiation. Plant Physiol. 2008 Jan;146(1):140-8. doi: 10.1104/pp.107.107870. Epub 2007 Nov 9. PMID: 17993548; PMCID: PMC2230548.