海量单细胞测序技术在CAR-T细胞治疗产品质量控制中的应用

CAR-T细胞治疗因在血液肿瘤中的出众疗效， 近几年已成为抗癌疗法的一颗新星。2017 年的8 月和10月，FDA批准分别批准了诺华公司的Kymriah和Kite Pharma 的 YesCarta。时隔三年之后，2020年7月，FDA批准了Kite的第二CAR-T细胞疗法，用于治疗罕见的B细胞非霍奇金淋巴瘤。截止到2020年6月底，全世界范围有671项CAR-T细胞治疗的临床试验在进行中(1)。

Jianshu Wei et al. Clinical development of CAR T cell therapy in China: 2020 update Cellular & Molecular Immunology

单细胞测序技术是在单个细胞水平上对基因组,转录组,表观组进行高通量测序的新技术,能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,是研究细胞异质性的有力工具，近几年越来越多的医药公司将该技术用于药物研发。早在2016年初，CAR-T治疗公司Juno就宣布收购AbVitro，理由是看中了他领先的单细胞测序平台，用于帮助Juno的免疫疗法开发。

目前批准的CAR-T细胞疗法均为自体T细胞，这种“活的药”每个产品都是独立批次，且个体之间存在较大的差异，因此质量控制是个难点。中国药监局和FDA也是相继出台指导原则对细胞治疗产品的质量进行控制。如细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）中对细胞治疗产品在生产过程中的质量要求如下(2)：

FDA 也是有一系列指导原则用于CAR-T细胞疗法的产品质量控制(3)。

The FDA’s Regulatory Framework for Chimeric Antigen Receptor-T Cell Therapies

CLAIRE RODDIE et al. Manufacturing chimeric antigen receptor T cells: issues and challenges，Cytotherapy, 2018; 00: 1-14

2019年发表于Genomics Proteomics Bioinformatics的一篇名为Single-cell Analysis of CAR-T Cell Activation Reveals A Mixed TH1/TH2 Response Independent of Differentiation的文章中，作者联合单细胞3’ mRNA高通量测序，多重细胞因子分析，活细胞成像细胞毒性分析等技术，系统的探讨了三代CAR-T细胞的活化状态与其表型，分化，信号传导和其他特征的关系。

CD4+和 CD8+可以同时在杀死肿瘤细胞中起作用，细胞毒性活性与表达上调的一系列细胞因子有关系。一些转录因子基因TBX21(T-bet)和GATA3及细胞因子基因IFNG(IFNc)，TNF (TNFa)，IL5 (IL5)，和IL13(IL13)等，说明TH1/TH2响应在其中发生。通过TGFB1和IL10的表达，可以推测CAR-T细胞具有Treg细胞活性，这部分细胞占比很低，另外大多数的CAR-T细胞还可以产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），且细胞因子的响应依赖于分化状态。

这项研究说明单细胞测序可以用于CAR-T细胞治疗产品以下方面质量控制

细胞特性控制方面：细胞基因型鉴定，分化潜能研究，表面标志物的表达及对外源性刺激的应答和表达产物的定性与定量的研究；

功能性分析方面：可以用于产品作用机制研究，以及结合临床应用适应症建立合理有效的生物学效力检测方法；

细胞纯度鉴定方面：亚细胞类别百分含量及功能性细胞含量；

安全性方面：可以用于研究非预期表达产物。

参考文献

1. Jianshu Wei et al. Clinical development of CAR T cell therapy in China: 2020 update. Cellular & Molecular Immunology,2020

2. 细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）

3. The FDA’s Regulatory Framework for Chimeric Antigen Receptor-T Cell Therapies

4. CLAIRE RODDIE et al. Manufacturing chimeric antigen receptor T cells: issues and challenges，Cytotherapy,2019

5. Iva Xhangolli et al. Single-cell Analysis of CAR-T Cell Activation Reveals A Mixed TH1/TH2 Response Independent of Differentiation, Genomics Proteomics Bioinformatics, 2019.

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