m6A甲基化数据分析流程

前面我们简单介绍过m6A RNA甲基化修饰特征,以及RNA m6A修饰发文套路大揭秘。那么今天小天就和大家一起探讨一下，m6A甲基化数据分析的基本流程。

m6A背景知识

目前已知有100多种RNA修饰，涉及到mRNAs、tRNAs、rRNAs、small nuclear RNA (snRNAs) 以及 small nucleolar RNAs (snoRNAs)等。其中甲基化修饰是一种非常广泛的修饰，N6-methyl adenosine (m6A)是真核生物mRNA上最为广泛的甲基化修饰之一，并存在于多种多样的物种中。

腺嘌呤可以被编码器（Writer）METTL3、METTL14和WTAP及其他组分组成的甲基转移酶复合体甲基化，甲基化的腺嘌呤可以被读码器（Reader, 目前发现m6A读码器主要有五个，定位于细胞核内的YTHDC1以及定位在细胞质中的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC2）所识别，同时m6A可以被擦除器（Eraser ）FTO和ALKBH5这两个去甲基化酶催化去甲基化。

在哺乳动物mRNA中，m6A修饰存在于7000多个基因中，保守基序为RRACH (R = G, A; H = A, C, U)。m6A修饰富集在mRNA终止密码子附近。

m6A检测方法

最近几年来m6A研究迅速发展，正是得益于meRIP-seq技术的开发及应用。meRIP-seq高通量测序技术的出现，能够高效精确检测全转录组不同的RNA 甲基化，是成功发现RNA 甲基化机理及功能的关键技术。MeRIP-seq 技术将甲基化DNA 免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation， MeDIP) 技术、RNA 结合蛋白免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation，RIP)技术和RNA 测序(RNA sequencing，RNA-seq) 技术组合起来，高精度地检测全基因组(或全转录组)范围内的RNA 甲基化。MeRIP-seq 技术采用免疫共沉淀方法，即甲基化RNA 特异性抗体与被随机打断的RNA 片段进行孵育，抓取有甲基化修饰的片段进行测序(IP),同时需要平行测序一个对照(Input)样本，对照样本用于消除抓取带有甲基化片段过程中的背景。然后将免疫共沉淀(IP)样本和对照样本中的序列片段对比(或定位)到参考基因组/ 转录组上，检测RNA 甲基化位点。对照样本测量对应RNA 的表达量，本质上是RNA-seq 数据。

MeRIP-seq 技术检测m6A 技术流程

m6A测序数据分析流程

m6A-seq数据分析的原理和过程跟ChIP-seq十分相似，大体包括如下几个步骤。

• 1. 原始read质控
• 2. 比对到参考基因组
• 3. Peak calling
  • 用R包exomePeak call peak
  • 用MACS2 call peak
• 4.Peaks注释
  • 用R包ChIPseeker注释peaks
  • 用R包Guitar注释peaks
• 5.差异peak鉴定
  • 用R包exomePeak鉴定差异peak
  • 用R包MeTDiff鉴定差异peak
• 6.差异peak对应基因的GO和KEGG富集分析
• 7.Motif分析
  • 用Homer进行motif分析
  • 用MEME进行motif分析

m6A测序数据分析流程

由于篇幅限制，小编将在后面几期的内容里面为大家做每一步的详细介绍，敬请期待。

参考资料：

1. m6A RNA甲基化修饰特征
2. RNA m6A修饰发文套路大揭秘