XYZeq：一种空间可辨的单细胞RNA测序揭示了肿瘤微环境中的表达异质性

背 景

在过去的十年里，组织单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)已经成为了用于分析组织细胞异质性的一种强有力工具，虽然借助于scRNA-seq可以了解组织样本中的细胞类型和异质性差异，但不能够提供细胞空间组织的信息。本文开发了XYZeq技术，该技术可将单细胞测序数据和细胞空间位置更好的整合在一起。

方 法 流 程

XYZeq流程的示意图

文章首先将组织切片低温固定在500 μm的芯片中心，该芯片包含数百个微孔，每个微孔里都包含组织空间信息的独特条形码反转录(RT)引物，在第一轮RT结束后，收集细胞混合物至试管内进行第二轮扩增，以确保每个细胞都带有唯一的第二个条形码。经测序后，可根据细胞所带的两个条形码更好的研究在组织中的确切位置。

研 究 结 果

01 XYZeq技术生成空间解析的scRNA-seq库

通过人类293T细胞和小鼠的3T3细胞混合物沉积到芯片中，创建不同的细胞比例梯度。经过计算去除污染和碰撞数后，得到293T细胞共939个独特的分子标识符(UMIs)和439个基因，以及3T3细胞共816个UMIs和336个基因。将每个单元格映射到其起源的芯片上，发现观察的细胞类型比例与预期的细胞类型比例具有很高的一致性。

XYZeq 可同时进行单细胞和空间转录体分析

02 XYZeq技术可同时捕获组织细胞信息及空间位置

将鼠的MC38结肠癌细胞肝内注射小鼠肿瘤模型。如前所述流程图，将小鼠肝组织固定冷冻在芯片上，同时将人的293T细胞沉积到芯片上作为混合物种的内部控制。经过质控和去除污染数后，捕获到1596个UMIs 和629个独特基因的鼠细胞，以及1009个UMIs和456个独特的基因的人细胞。并且观察到293T细胞分布在整个组织中，而小鼠细胞则分布在组织的边界处。

空间性的分析组织中捕获的单细胞转录组

03 XYZeq可以确定细胞的空间位置

为了确定可以从肿瘤组织中准确区分肝细胞，对肝细胞和癌细胞的密度与相邻切片的组织学注释重叠，对空间的细胞进行量化分析发现，间充质干细胞(MSC)、淋巴细胞、骨髓细胞与癌细胞共定位，Kupffer细胞、LSECs与肝细胞共定位。发现肿瘤浸润组织中可能存在细胞相互作用区域。通过对各孔细胞类型比例的两两相关性分析，证实了这些定性观察结果。

组织单细胞群的空间映射及其细胞群频率

04 XYZeq的scRNA-seq和空间数据的联合分析可以识别空间变量基因模块

在空间上的变化，部分是由肿瘤微环境中的细胞组成驱动的，由于肝脏和脾脏都注射了相同的肿瘤细胞系，入侵的肿瘤可能会诱导一个共享的基因表达特征。为了验证这一假设，首先从NMF分析中确定了两个组织之间的匹配基因模块对。发现了四个不同的肝脏模块(LM)与脾脏/肿瘤模块至少有25%的基因重叠，这些模块的基因本体论分析揭示了肿瘤反应、免疫调节和细胞迁移相关基因的富集。并发现这些重叠模块的表达在癌细胞密集浸润的区域最高。综上所述，在组织样本之间的细胞存在差异时，XYZeq可以将scRNA与空间数据相联合分析，可以运用到组织样本之间细胞存在差异时的检测。

在空间中用细胞组成跟踪的基因模块的表达

05 YZeq联合分析可以检测在复杂组织结构中的位置驱动的转录变异基因

接下来将分析重点放在由MSC表达的LM10和SM15/SM17匹配模块上。首先根据微孔的组成和距离计算每个微孔的肿瘤接近分数，并将接近分数映射到tSNE空间中的MSC上，可以发现转录异质性与肿瘤的空间接近性相关，然后分析得到了177个基因来自于肝脏肿瘤组织，66个基因来自于脾脏肿瘤组织。并发现许多不同表达的基因参与调节了细胞外基质，表明MC38细胞可诱导相近的MSC局部表达程序变化从而导致细胞外基质的恶性重塑。在进一步的分析发现，脾脏肿瘤中CSmd1表达水平较低，但Tshz2水平较高，更接近肿瘤，这些基因在空间的表达模式与上述空间轨迹分析一致，表明它们在MSCs中的异质表达可能是由细胞相对于肿瘤的位置决定的。这些结果表明，通过对XYZeq的空间和单细胞转录组数据的联合分析，可以检测特定细胞类型(如MSCs)中受其在复杂组织结构中的位置驱动的转录可变基因。

MSC内部与肿瘤空间接近相关的微分基因表达

结 论

XYZeq是一种新的scRNA-seq分析技术，该技术将每个细胞置于复杂组织的空间环境中，实现对细胞转录组的分析，同时能够了解到细胞类型及状态。在小鼠肿瘤模型中，还证实了XYZeq并能识别由细胞组成决定的基因表达的空间变异模式，以及由空间邻近性决定的细胞类型内的异质性。

XYZeq技术能够运用到多种组织样本的检测中，并且为更好地理解组织微环境如何影响健康和疾病中的细胞浸润和相互作用提供了方法

参 考 文 献

1. Patel A. P., Tirosh I., Trombetta J. J., Shalek A. K., Gillespie S. M., Wakimoto H., Cahill D. P., Nahed B. V., Curry W. T., Martuza R. L., Louis D. N., Rozenblatt-Rosen O., Suva M. L., Regev A., Bernstein B. E., Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science 344, 1396–1401 (2014).

2. Patel A. P., Tirosh I., Trombetta J. J., Shalek A. K., Gillespie S. M., Wakimoto H., Cahill D. P., Nahed B. V., Curry W. T., Martuza R. L., Louis D. N., Rozenblatt-Rosen O., Suva M. L., Regev A., Bernstein B. E., Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science 344, 1396–1401 (2014).