Nature Methods|具有组合流体索引的超高通量单细胞RNA测序方法

研 究 背 景

细胞图谱项目和高通量扰动筛选所需的单细胞测序规模较大，对当前技术是一个挑战。而基于液滴的scRNA-seq中，为了降低细胞的双细胞率，将单细胞悬液以很低的浓度加载到微流控装置中，使得两个细胞几乎不可能进入同一液滴。甚至导致某些液滴接收不到细胞，从而降低scRNA-seq试剂使用效率，该方法对于大型研究而言成本过高。因此作者设计了一个超高通量单细胞RNA测序方法。

方 法 流 程

首先在透化细胞内进行一轮全转录组预索引，然后进行液滴过载的 scRNA-seq，可以显著提高现有微流体液滴的产量。作者将该条形码方法称为“单细胞组合流体索引”(scifi)。在 scifi-RNA-seq中，细胞或细胞核被透化，它们的转录组通过“分裂池”中的逆转录带上预索引条形码标记(round1)，然后通过高度过载标准微流体液滴汇集、随机混合和封装含预索引cDNA 的细胞或细胞核，使大多数液滴接收多个细胞或细胞核。在过载的液滴内，转录本被标记有液滴特定的微流体(round2)条形码。round1 条形码标记同一“拆分池”中的所有细胞，round2 条形码标记同一液滴中的所有细胞，通过两个条形码的组合特异地识别来自同一单细胞的转录本。

研 究 结 果

▎微流体液滴发生器支持大量过载

scifi-RNA-seq可行性的条件是微流体液滴发生器可以承受大量过载(即在同一个液滴中包裹几个单细胞或细胞核)，又能保持稳定的单分散液滴乳液，且不会堵塞设备。将不同浓度的人类 Jurkat 细胞单核悬液加载到微流控芯片中。结果发现，液滴直径不变的条件下，随着负载浓度的增加，液滴填充率和每个液滴的核数以可控的方式增加到95.5%，每个液滴平均 9.6 个核。确定液滴过载技术的可行性后，作者量化了scifi-RNA-seq实验，分析单个转录组十万到数百万个核所需的预索引规模。使用 ATAC 试剂提供的 737,280 个不同的微流体(round2)条形码，分析表明scifi-RNA-seq可以用96个round1指标解析100万个单细胞转录组，具有操作方便、设置成本低等实际优势。此外，具有384孔预索引的scifi-RNA-seq远远超过了三轮组合索引的条形码容量。

▎预索引和液滴超载提高了scRNA-seq通量

为了评估scifi-RNA-seq液滴超载的性能，作者将15,300、383,000和 765,000 个预索引核进行单细胞测序。确定了在基于液滴的 scRNA 实验中将细胞/细胞核与噪声分开的单细胞条形码中UMI分布的拐点。发现回收的单细胞转录组的数量与加载的细胞核数量成比例。并且，预索引能够从测序数据中确定每个液滴(由 round2 条形码识别)中单核的有效数量(由 round1 条形码识别)。每个液滴内的平均核数以可控方式增加。当加载浓度为765,000个核时，每个液滴内平均有4.4个核。这些结果表明，scifi-RNA-seq 在广泛的加载浓度范围内以可比的效率回收细胞核，与基于液滴乳液目视检查的核计数数据的统计模型一致。

通过比较仅基于微流体(round2)条形码的人/小鼠细胞doublets的数量和基于预索引(round1)和微流控(round2)条形码组合的doublets数量。结果发现，大多数液滴同时包含人和小鼠细胞，但结合round1和round2条形码可以分析出绝大多数的doublets；并且只有当液滴过载时，才能体现预索引对细胞doublets的显著影响，验证了该预索引策略可以将转录本正确归类到单个细胞。将每个细胞的UMI计数和每个细胞的特异读数的分数与每个液滴的细胞核数量作图时，从图中没有看出含有15个单独细胞核的液滴中转录组复杂性降低的趋势，说明基于液滴的索引足以对来自多个核的转录组进行有效的微流体索引，因此索引试剂不是scifi-RNA-seq的限制因素。

▎scifi-RNA-seq在系统基准测试中表现良好

确定了scifi-RNA-seq 技术可行性后，接着对该方法的实证表现进行基准测试。比较scifi-RNA-seq与标准scRNA-seq技术工作流程，结果发现scifi-RNA-seq在新鲜细胞上没有达到标准流程的性能，但背景较少，可能是由于其严格的洗涤和过滤步骤。并且scifi-RNA-seq的细胞恢复率略有降低。

标准流程的数据中有细胞doublets，而 scifi-RNA-seq没有，表明scifi-RNA-seq比标准流程更不易受细胞doublets的影响。通过比较scifi-RNA-seq和标准scRNA-seq的转录组谱、差异基因、P值和检验统计，进一步证实scifi-RNA-seq与标准scRNA-seq的一致性。

▎scifi-RNA-seq适用于细胞系和原代样本

接着通过大规模 scifi-RNA-seq实验证明该方法的通量。对383,000个核进行实验。结果有151,788个单细胞转录组通过了质量控制，比标准scRNA-seq的输出量增加了15倍。所有细胞经过聚类有明确的分离。并且转录组数据质量高，即使是单个标记基因的K562的ABL1和NALM-6的PAX5也能够区分不同的细胞系。无需过滤高覆盖率的转录组也可从每个细胞系的前100个差异基因的表达中立即聚类。对公开获得的基因表达特征进行富集分析，根据其基因表达谱准确地鉴定出相应的细胞系。因此，对约150,000个单细胞转录组的分析证实了scifi-RNA-seq为人类细胞系提供了高质量的转录组谱。

▎scifi-RNA-seq支持单细胞扰动筛选

作者通过单细胞转录组CRISPR筛选来研究了TCR激活的关键调节因子。证明了scifi-RNA-seq中的预索引步骤不仅可以实现大量液滴过载和随后的doublets分析，而且还允许在单个大型实验中组合多样本分析。

结 论

为了对数百万个单个细胞进行经济高效的单细胞测序，作者开发了“单细胞组合流体索引”(scifi)。scifi-RNA-seq 大大提高了基于液滴的单细胞 RNA-seq 的通量，并可以在一个实验中同时对多个样本进行单细胞RNA-seq。scifi-RNA-seq与多轮组合索引相比具有简单高效的工作流程。与标记和丢弃包含多个细胞液滴的cell hashing方法相比，可以解析并保留来自过载液滴的单个转录组。之后作者在人类和小鼠细胞系上对 scifi-RNA-seq 进行了基准测试，针对原代人类T 细胞对其进行了验证，最后将scifi-RNA-seq应用在单细胞转录组高度多重CRISPR筛选中，来研究TCR激活的关键调节因子。

参 考 文 献

Paul Datlinger, André F. Rendeiro, Thorina Boenke, Martin Senekowitsch, Thomas Krausgruber, Daniele Barreca & Christoph Bock. Ultra-high-throughput single-cell RNA sequencing and perturbation screening with combinatorial fluidic indexing. Nature Methods, 18, 635–642 (2021).