RNA m6A检测方法
前面给大家简单介绍过m6A甲基化的概念，也给大家介绍了
☞m6a甲基化相关基因根据临床信息分组绘制boxplot并显示p值
m6A检测方法
最近几年来m6A研究迅速发展，正是得益于meRIP-seq技术的开发及应用。meRIP-seq高通量测序技术的出现，能够高效精确检测全转录组不同的RNA 甲基化，是成功发现RNA 甲基化机理及功能的关键技术。MeRIP-seq 技术将甲基化DNA 免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation， MeDIP) 技术、RNA 结合蛋白免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation，RIP)技术和RNA 测序(RNA sequencing，RNA-seq) 技术组合起来，高精度地检测全基因组(或全转录组)范围内的RNA 甲基化。MeRIP-seq 技术采用免疫共沉淀方法，即甲基化RNA 特异性抗体与被随机打断的RNA 片段进行孵育，抓取有甲基化修饰的片段进行测序(IP),同时需要平行测序一个对照(Input)样本，对照样本用于消除抓取带有甲基化片段过程中的背景。然后将免疫共沉淀(IP)样本和对照样本中的序列片段对比(或定位)到参考基因组/ 转录组上，检测RNA 甲基化位点。对照样本测量对应RNA 的表达量，本质上是RNA-seq 数据。
MeRIP-seq 技术检测m6A 技术流程
当然做完IP我们也可以直接做qPCR，称为MeRIP-qPCR，大体流程如下
第一步，先对RNA进行特异性富集和打断。即在打断之前，我们需要搞清楚研究对象只是mRNA还是lncRNA。若只研究mRNA 可以先用oligodT磁珠进行富集后再进行打断。如果是lncRNA和mRNA都要研究，则需要先用试剂盒将total RNA的rRNA先去除干净，再进行打断。如果是进行高通量测序打断长度约为100nt左右，而qPCR 则需要长度至少在200nt以上，部分论文甚至打断长度在300-500nt左右。一般根据文献中的资料显示，IP下来的片段用引物扩增出来的长度在130-150左右，所以100nt不到的长度要设计出合适的引物会非常困难。除非是用5’RACE扩增，否则还是建议大于200nt。当然了，如果不打断的话设计引物就会比较方便。当然如果 total RNA 本身量比较少，建议直接用 m6A 抗体对 total RNA 进行富集。
第二步，对 RNA 进行抗体孵育和特异性富集。打断完了 RNA 我们会得到长度约为 200-300 的 RNA 片段。如果是不打断则是较为完整的 RNA 全长。这时候我们可以分出约占 m6A-IP 部分 RNA 只有 10%的 RNA 作为 input。当然如果是细胞样本比较充足，Input 和 IP 的比例可以直接是 1:1。如果按照 1:1:1，简单来说用于 m6A IP 的 RNA 有,3μg，那么 Input、 IP 和 IgG 的 RNA 都在 1μg 左右（无论是 total RNA 还是 mRNA）。
第三步，洗脱和逆转录扩增。接下来我们需要对m6A抗体和IgG抗体上洗脱下来的RNA，以及input的RNA，按照常规试剂盒要求进行洗脱，并用随机引物进行逆转录。
第四步，设计m6A-IP–qPCR 的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区，所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现，那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物长度会在130-150bp左右。这里需要注意的是，IP下来的RNA需要用随机引物进行逆转录，而第四步中设计的引物用的是特异性引物，这个大家要注意区分和甄别。
第五步，使用上一步设计好的引物，对input、m6A-IP和IgG-IP中的RNA进行qPCR反应并计算相应的CT值。
MeRIP-qPCR结果的计算 MeRIP-qPCR结果计算如下表:
*其中DF和IF分别是稀释倍数。是说一个样品，由于其中IP到的RNA量一定会比不IP直接保留的Input的RNA量少很多，IP和Input实际取来做逆转录+qPCR的模板稀释倍数不同，因此要把这个倍数考虑进去。比如15μg的片段化RNA经过IP后的RNA全部拿去做IP样品的qPCR实验得到Ct值A1, 另3μg的片段化RNA用来作为Input样品qPCR得到Ct值B1，则%(IP/Input)=2(B1-A1)*（3/15）*100。IgG/Input的计算也是同理。