在☞RNA m6A检测方法一文中我们介绍了MeRIP-qPCR这种方法。在第四步中我们提到IP下来的RNA需要用随机引物进行逆转录，而第四步中设计的引物用的是特异性引物，这个大家要注意区分和甄别。有人可能会比较好奇，这个特异性引物是怎么设计的。首先我们需要确定m6A究竟发生在mRNA上的什么位置，接下来才能确定究竟应该在哪里放特异性引物。

下图是一个m6A位点在mRNA上的分布图，可以看出m6A修饰倾向于富集在终止密码子附近。当然在5‘UTR和编码区也有。

以上只是一个大规模的统计结果，那么针对于不同的mRNA，m6A位点究竟存在于什么位置呢？今天就给大家介绍一个免费在线预测哺乳动物m6A修饰位点的网站SRAMP。

网址：http://www.cuilab.cn/sramp

1. 首先进入SRAMP网页

点击“Prediction”按钮

2. 选择预测的模型

左边的“Full transcript mode”在对编码和非编码RNA进行预测时，建议使用此模式。注意，在该模式中，应使用完整转录物（具有内含子）而不是成熟mRNA / cDNA序列的基因组序列。而对于没有完整基因组序列的用户来说，可以选择右侧的“Mature mRNA mode”，这种预测模式是一种备选解决方案，相对来说预测的准确性不如左边的，该模型适用于成熟mRNA（cDNA）序列，不能预测内含子中的m6A位点。

我们用网站默认的test1(TROVE2)序列演示一下，后面的选项都是默认的，点击“Submit”就可以预测序列的m6A结合位点了。

3. 预测结果

有两个结合位点，在“Decision”列中可以看出预测的两个结合位点具有很高的可信度。SRAMP网站提供了几个阈值：99 %/95%/90%/85%，分别对应very high/high/moderate/low的自信度，当然我们一般都挑选“very high”啦。预测结果是按照“Position”位置排序的，所以还需要综合各个位点“Score”情况。