基于结构的药物设计: RANKL-靶向的抗骨质疏松小分子药物的发现

2022年9月12日，Nature Communications 在线发表题为“Identification of a binding site on soluble RANKL that can be targeted to inhibit soluble RANK-RANKL interactions and treat osteoporosis”的研究论文，报告了一种选择性地抑制sRANKL-RANK的First-In-Class小分子先导化合物，实现无免疫副作用抗骨质疏松药的梦想。文章的共同第一作者为中山大学药学院徐峻-顾琼-周晖皓课题组的黄丹娥博士和赵超博士。

骨质疏松是老龄化社会的重大问题，国家统计局的数据显示：到2050年，我国骨质疏松症患者约为3亿。目前，治疗骨质疏松的唯一靶向药是地诺单抗，于2010年在欧盟和美国获得批准，2022年2月才在我国获批上市。

地诺单抗是人源性单克隆抗体，除了价格昂贵之外，长期使用还可能产生免疫原性副作用，包括背痛、四肢痛、高胆固醇血症、眩晕、贫血、胃食管反流病、带状疱疹、失眠、咽炎等。

受体激活NF-κB的配体(简称RANKL)有sRANKL和mRANKL两种形态，前者称为可溶性RANKL，它的过度表达造成破骨细胞过度生成，是导致骨质疏松的核心机制。mRANKL被固定在细胞膜上，维持免疫系统的稳定性。地诺单抗通过抑制sRANKL与它的受体RANK的结合而阻止破骨细胞的过度生成，实现对骨质疏松的特异性治疗。

但是，由于地诺单抗无差别地抑制sRANKL和mRANKL，造成免疫副作用。

鉴于sRANKL和mRANKL除了前者可以自由运动，后者被固定在细胞膜上这个小差别之外，它们在与RANK的结合面上没有差别，因此，本质上，地诺单抗无法选择性地抑制sRANKL，即，副作用无可避免。

图1、地诺单抗免疫副作用

鉴于RANKL需要形成三聚体后再与RANK结合才能形成RANKL-RANK复合物。作者认为：小分子可以自由地攻击sRANKL，而难以攻击固定在细胞膜上的mRANKL，因此，有可能发现选择性地抑制sRANKL的小分子药物。

为了发现无副作用的抗骨质疏松小分子靶向药物，作者利用sRANKL的晶体结构(PDB ID:1S55)分别构建了sRANKL和mRANKL的三聚体模型；通过分子动力学模拟它们100ns时间范围的构象变化。模拟结果表明：四个关键残基对(Y236-H226、Y236-D303、K182-H226和Q238-D303)在sRANKL和mRANKL中表现出不同的行为，它们所围成的口袋呈现了不同的形状。sRANKL的口袋更宽且深。

图2、sRANKL比mRANKL有更深、宽且柔性的结合口袋

为了验证模拟计算的结果，课题组对sRANKL进行了单点突变实验。表达了K182A、R224A、H226A、E227A、Q238A、Y242A、E270、D301A、D303A九种sRANKL的突变体。分别测试了这些突变体与野生型sRANKL对诱导破骨细胞增生的影响。结果表明，这些sRANKL的突变体蛋白除了Q238A外，都不能诱导破骨细胞增生。

因此，作者认定K182、R224、H226、E227、Y242、E270、D301和D303是干扰sRANKL-RANK结合的关键残基，它们围成的结合口袋是抗骨质疏松小分子药物的结合位点。

图3、实验证明对K182、R224、H226、E227、Y242、E270、D301和D303残基突变之后破骨细胞生长受到抑制，它们形成的口袋是抗骨质疏松小分子药物的可药结合位点

根据上述实验结果，作者用基于化学基元和点击化学结合的方法，设计、合成、筛选发现了一系列破骨细胞小分子抑制剂(文章另发，参见Identifying novel anti-osteoporosis leads with a chemotype-assembly approach, J. Med. Chem., 2019, 62(12), 5885-5900)。

SPR实验、破骨细胞筛选实验都证明S3与sRANKL有强的非共价结合，且有纳摩尔级的抑制破骨细胞能力。进一步对S3进行结构优化，成药性显著提高。(图4)，发现了药效和药代动力学更佳的先导化合物S3-15。

图4、SPR实验、破骨细胞筛选实验证明S3-15是更好的先导化合物

为了确证S3-15选择性地结合sRANKL，作者制备了固化的sRANKL的二元复合物(L-RANKL)以模拟mRANKL被固定在细胞膜上的行为。实验表明，这种mRANKL的模拟物仍有诱导破骨细胞生长的活性(图5)。

图5、mRANKL模拟物(L-RANKL)有诱导破骨细胞的能力

用等温滴定量热法(ITC)测量S3-15与sRANKL和L-RANKL的亲和力。结果表明，S3-15与sRANKL(KD=5.78mM)的结合力明显强于S3-15与L-RANKL(KD=124mM)的结合力(图6a)。

图6、实验证明S3系列小分子化合物选择性地结合sRANKL

饱和转移差谱(STD-NMR)实验也证明了S3-15对sRANKL的选择性(图6b-d)。破骨细胞抑制实验进一步表明S3-15与sRANKL结合导致剂量依赖性地抑制破骨细胞生长(图6g)。

作者合成了生物素标记S3衍生物作为化学探针进行基于活性的蛋白质谱分析(ABPP)，结果表明，S3-15能够从破骨细胞内各种蛋白质中准确识别sRANKL。

为了验证S3-15与sRANKL的结合导致破骨细胞的抑制，作者进行了两项体外拯救实验发现，sRANKL的突变体Q238A可刺激破骨细胞分化(图3)但与S3-15无亲和力；当S3-15与Q238A sRANKL突变体共孵育时，不能阻止破骨细胞生成；而破骨细胞与野生RANKL共孵育时，S3-15可以抑制破骨细胞的生长；另一项拯救实验使用了一种不能刺激破骨细胞分化但能与S3-15结合的sRANKL突变体H226A。S3-15与该突变体共孵育时，破骨细胞数量以剂量依赖性地被挽救；而野生RANKL诱导的破骨细胞生成则可以被S3-15所抑制。救援实验还用W194A sRANKL突变体(类似于H226A sRANKL，没有破骨细胞生成活性，但与S3-15结合)也具有相同的结果。这些结果都表明S3-15与sRANKL结合的确抑制破骨细胞的生长。

为了研究S3-15的分子作用机制。作者对15个sRANKL上的关键氨基酸残基进行突变，用pull-down和STD-NMR实验确定了S3-15与sRANKL的结合口袋（图7a,b,c）。分子动力学模拟实验进一步确定了它们的结合模式（图7j）。

模拟实验还表明S3-15与mRANKL结合明显困难，而与sRANKL产生诱导契合效应，形成更紧密的复合物（图7i和j），从而诠释了S3-15选择性结合sRANKL的机制。

图7、S3-15选择性结合sRANKL的机制

为了评价S3-15对破骨细胞中的关键蛋白和基因的作用，作者通过荧光报告基因实验发现S3-15调控NFATC通路(图8c和d),它们与破骨细胞分化和功能高度相关,尤其是Ctsk、MMP9、Oscar、Calcr和Tracp都在S3-15的作用下受到抑制（图8e）。S3-15除了抑制破骨细胞分化之外，也诱导成熟的破骨细胞凋亡（图8f）、抑制破骨细胞的骨吸收功能、促进成骨细胞的矿化（图8g和h）。

图8、S3-15抑制破骨细胞分化相关蛋白的活性和基因表达、促进成骨细胞成熟

为了确认S3-15不干扰免疫系统的功能，作者用S3-15和地诺单抗测试健康人和癌症患者的T细胞分化，证明S3-15不影响T细胞的功能而地诺单抗则抑制T细胞（图9）。证明S3-15选择性地抑制sRANKL可以排除免疫副作用。

图9. S3-15对人T细胞的分化没有影响

最后，作者在大鼠和小鼠体内对S3-15进行了全面的成药性评价。S3-15能显著地提高骨质疏松大鼠和小鼠的骨密度（图10a和c）、显著改善血液中骨吸收和骨生成的指标（PINP、CTX-1和OCN）（图10b）。

当前骨质疏松药的主要缺陷是无法降低骨折风险。骨生物力学实验表明S3-15能够显著提高骨质的最大承受力以降低骨折风险（图10c）。对骨质疏松小鼠的免疫系统的检测结果表明：S3-15对免疫细胞的分化、脾脏（发挥免疫功能的主要脏器）以及脾脏中的免疫细胞数量没有影响（图10d-g）。

图10. S3-15增加骨质疏松模型动物的骨密度且不影响免疫系统

本文工作表明RANK-RANKL是抗骨质疏松药物的良好靶点，为RANKL-靶向的抗骨质疏松First-In-Class小分子药物的成功开发铺平了道路。本文报道的研究成果已经在深圳三启生物落地转化。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-33006-4

文章DOI：10.1038/s41467-022-33006-4

--------- End ---------