文献分享(1)|S63845：肿瘤研究中的高效MCL抑制剂

1.细胞凋亡的概念

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。正常的细胞凋亡是在一系列基因的激活、表达以及调控下有序进行的，机体无炎症反应，且对整个机体的发育是有利和必须的。但肿瘤细胞中，凋亡过程是被抑制的，导致肿瘤细胞无限制地生长、繁殖。通过对多种癌症的研究表明，MCL-1蛋白的过度堆积，可能是肿瘤细胞细胞凋亡进程被抑制的重要原因。

细胞凋亡过程的模式图

2.S63845简介

MCL-1蛋白属于抑制细胞凋亡的BCL-2分子家族，它存在于众多肿瘤中。之前从未有过该蛋白的抑制剂被合成，而此次发现的S63845填补了这一项空白。S63845以高亲和力特异性结合MCL-1的BH3结合槽，通过激活BAX/BAK依赖性线粒体凋亡途径，高效地杀死MCL-1依赖性癌细胞，其中包括多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤细胞。

在发现这一分子后，实验人员在免疫受损小鼠体内移植了多发性骨髓瘤细胞H929和AMO1，之后静脉注射S63845，得到的结果令人振奋：S63845在H929模型中最大的肿瘤生长抑制为103%，在AMO1模型中最大的肿瘤生长抑制为114%，并且在AMO1模型中，S63845注射剂量在25 mg/kg时，8只小鼠通过一百天治疗有7只小鼠的肿瘤完全消退。

通过进一步的研究表明，这一MCL-1蛋白的抑制剂在单独或与其他抗癌药物组合使用时，对一些固态肿瘤细胞系也同样有效。更加令人惊喜的是：在药物作用的有效剂量下，正常细胞对S63845完全耐受，未来的病人在合理使用S63845时，很可能不需要忍受副作用的痛苦。因此，S63845小分子的发现，意味着“广谱抗癌药物”成为了可能。它或将帮助制药企业开发出针对多种癌症的新型药物。

3.凋亡通路核心分子家族成员介绍

（1）Bcl-2家族

Bcl-2家族最有代表性的家族成员就是Bcl-2分子。Bcl-2分子内含有四个同源结构域，分别是BH1-BH4。家族成员根据分子内所含有的同源结构域的差异，可以分为三个不同的亚家族：

1）Bcl-2亚家族

属于这个亚家族的成员，几乎都含有BH1和BH2结构域。Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起到抑制的作用。

2）Bax亚家族

Bax亚家族都含有BH3结构域，但是除了BH3结构域之外，也含有其他的BH结构域。Bax亚家族成员所起到的作用和Bcl-2亚家族成员的功能正好相反，它们起到促进细胞凋亡的作用。

3）BH3亚家族

这个亚家族内的成员，只含有BH3结构域。它们的作用也是促进细胞凋亡。

在Bcl-2家族内，最明星的两个分子是Bcl-2分子和Bax分子。当细胞内Bax高表达时，细胞对死亡信号敏感，促进了细胞发生凋亡。当Bcl-2高表达时，Bcl-2可以和Bax形成异源二聚体，抑制细胞凋亡。所以细胞内Bcl-2/Bax的比例对决定细胞凋亡的敏感性起到重要作用。

Bcl-2家族的分类和结构示意图

（2）Caspase家族：

Caspase家族是一组蛋白酶，介导即将死亡的细胞高效且特异的蛋白水解作用，是细胞凋亡过程中非常重要的效应分子。Caspase蛋白水解酶有三个特征：1）都是半胱氨酸蛋白酶；2）作用位点都在天冬氨酸残基后的位点；3）Caspase家族成员都是以酶原的形式存在，需要经过活化。

Caspase家族成员，可以按照功能分为三组：

1）凋亡启动亚类Caspase蛋白酶（apoptoticinitiation）

这一类Caspase包括Caspase-2、8、9和10。它们是细胞凋亡的起始分子。

2）凋亡效应亚类Caspase蛋白酶（apoptoticexecution）

这一类Caspase包括Caspase-3、6和7。它们是具体执行细胞凋亡的效应分子。因此凋亡效应类的Caspase蛋白酶在信号传导的过程中始终处于凋亡启动类Caspase蛋白酶的下游。

3）细胞因子激活类Caspase蛋白酶（cytokineactivation）

这一类Caspase包括Caspase-1、4、5和13。这一类Caspase分子与细胞凋亡的关系不是很密切，可能与多种炎症因子或者细胞因子的成熟有关。

4.介导凋亡的通路

介导凋亡的通路有三条：分别是线粒体通路；内质网通路和死亡受体通路。

（1）线粒体通路

线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置。在线粒体通路中，死亡信号激活含BH3结构域的Bcl-2家族成员，例如Bax。这些含BH3结构域的Bcl-2家族成员（例如Bax）发生寡聚化，并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素C(CytC)和其他蛋白。

CytC的释放是线粒体凋亡路径的关键限速步骤。CytC与凋亡蛋白酶活化因子(apoptoticprotease-activatingfactor，Apaf-1)形成多聚复合体，通过Apaf-1氨基端的Caspase募集结构域(caspaserecruitmentdomain，CARD)，募集胞质中的Caspase-9前体，并使其自我剪切活化，然后启动Caspase级联反应，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡。

线粒体是细胞能量代谢的中心。细胞凋亡过程中，对线粒体损伤后最直接的结果是线粒体正常功能的丧失。线粒体功能障碍，除了会直接诱导细胞凋亡外，还会导致自由基产生增加、兴奋性氨基酸释放增多、钙离子超载等现象。如果细胞的损伤程度相对较轻，ATP能提供细胞凋亡所需的能量，则发生细胞凋亡；若细胞的损伤程度较为严重，ATP急剧耗竭，则细胞发生坏死现象。

线粒体通路

（2）内质网通路

内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网在维持细胞内钙离子的稳定以及膜蛋白的合成、修饰和折叠等方面都发挥关键性作用。当内质网内，钙离子平衡被破坏或者内质网蛋白的过量积累，都会诱导Caspase-12在内质网膜上的表达，同时内质网也介导了胞质的Caspase-7转移到内质网表面并激活Caspase-12。激活后的Caspase-12可进一步剪切Caspase-3，引发细胞凋亡。内质网的功能失调在某种程度上可以影响线粒体通路的凋亡现象。许多细胞在凋亡早期，由于内质网中Ca2+的释放，会导致胞质内Ca2+浓度迅速且持续的升高。高浓度的Ca2+可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶，又可以作用于线粒体，影响线粒体的通透性并导致线粒体膜电位的改变，从而促进凋亡。

（3）死亡受体通路

胞外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内。死亡受体为一类跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因超家族。它们胞外部分都含有一个富含半胱氨酸的区域，胞质区有一个由同源氨基酸残基构成的结构。这个结构具有蛋白水解功能，被称为“死亡结构域”(deathdomain，DD)，可使死亡信号得以进一步传递，最终启动凋亡。

已知的死亡受体有五种：1）TNFR-1(又称CD120a或p55)；2）Fas(又称为CD95或Apo1)；3）DR3(死亡受体3deathreceptor3，又称Apo3)；4）DR4（死亡受体4，又被称为TRAIL-R1）；5）DR5（死亡受体5，又被称为Apo2，TRAIL-R2)。

与死亡受体相互对应的就是死亡配体（ligand）。与TNFR对应的死亡配体是TNF（肿瘤坏死因子）；和Fas对应的死亡配体是FasL(CD95L)；和DR3对应的死亡配体是Apo-3L(DR3L)；和DR4以及DR5对应的死亡配体是Apo-2L(TRAIL)。

Fas/FasL通路和 TNF/TNFR通路在其中最为重要。

5.凋亡的检测方法

（1）形态学

光学显微镜下细胞缩小、核浓缩、细胞周围出现透明圈等现象。相差显微镜下细胞鼓泡，凋亡小体的产生等现象。透射电镜观察到细胞表面微绒毛的消失、核染色质沿核膜分布、新月体形成及凋亡小体的形成等现象。

（2）流式细胞检测（Annexin V-PI双染色实验）

AnnexinV-PI双染色实验是用于检测凋亡的经典实验方法。

在正常细胞中，磷酯酰丝氨酸只分布在细胞膜的脂质双分子层的内侧。当细胞发生凋亡的早期阶段，磷酯酰丝氨酸从细胞膜内侧外翻到细胞膜的外侧。AnnexinV作为一种磷脂结合蛋白，与磷酯酰丝氨酸有高度亲和性。它通过细胞外侧暴露的磷酯酰丝氨酸与凋亡早期细胞的细胞膜结合。因此，AnnexinV是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。PI是一种核染料，它不能透过完整的细胞膜。但是在凋亡的晚期阶段或者是细胞发生坏死现象，由于细胞膜的完整性已经遭到破坏，使得PI能够透过细胞膜与细胞核发生结合。因此，通过AnnexinV-PI双染色实验，再通过流式细胞仪进行检测，可以把细胞分为四种类型：

1）AnnexinV阴性且PI阴性（双阴性细胞），这类细胞是活细胞；

2）AnnexinV阳性且PI阴性，这类细胞是早期凋亡的细胞；

3）AnnexinV阳性且PI阳性（双阳性细胞），这类细胞是晚期凋亡或者是坏死的细胞；

4）AnnexinV阴性且PI阳性，这种情况可能是由于非特异性染色导致的。因为AnnexinV阴性，表示磷酯酰丝氨酸没有外翻，说明细胞膜依然具有完整性。PI不能透过完整性的细胞膜和细胞核结合，因此从理论上讲，不存在AnnexinV阴性而PI阳性的细胞。

Annexin V-PI双染色实验结果示意图

（3）核酸电泳检测细胞凋亡（DNA片段检测法）

当细胞发生凋亡时，小分子DNA片段不断增加，高分子DNA片段不断减少。凋亡细胞DNA断裂的特点是DNA断裂不是随机的，而是由于内源性的内切酶作用，因此DNA的断点都是规律性的发生在核小体之间，因此出现的DNA片段都是180-200bp的片段或者是180-200bp整数倍的DNA片段。在凝胶电泳中，如果出现这种特征性的电泳条带，就可以判断细胞发生了凋亡。

（4）凋亡明星分子检测

通常检测明星分子，采用的是Western Blot的方法检测蛋白。因此，结合线粒体通路，首先是检测激活的Cas-9。然后激活的Cas-9再级联放大激活下游的Cas-3，所以Cas-9和Cas-3几乎是逃不掉的两个明星分子。前体分子是Pro-cas-9和Pro-cas-3。在检测之前，大家需要好好看看抗体的说明书。因为有些抗体只识别前体Cas-9和前体Cas-3，有些抗体即能检测前体Cas-9和前体Cas-3，又能检测激活后的Cas-9和Cas-3。

另外，Cas-3激活后可以作用于很多的底物之上，最常检测的Cas-3的底物是PARP分子。另外，在凋亡发生时，Bcl-2家族成员发挥了重要的作用。例如，抑制凋亡的Bcl-2和促进凋亡的Bax。因此，常常通过western检测Bcl-2和Bax的表达量，通过Bcl-2/Bax的比值，表征细胞凋亡的程度。对于死亡受体介导的凋亡通路，Fas、FasL、TNF和TNFR，都是常规需要检测的明星分子。在FasL-Fas通路以及TNF-TNFR通路之下，都涉及到FADD分子。所以检测FADD也是非常常见的。但是，在TNF-TNFR通路之下，由于这条通路非常地复杂，具体问题具体分析即可。

参考文献：

[1] Letai A, et al. S63845, an MCL-1 Selective BH3 Mimetic: Another Arrow in Our Quiver. Cancer Cell. 2016 Dec 12;30(6):834-835.  

[2] Kotschy A, et al. The MCL1 inhibitor S63845 is tolerable and effective in diverse cancer models. Nature. 2016 Oct 27;538(7626):477-482.   作者：MCE抑制剂 https://www.bilibili.com/read/cv19069630 出处：bilibili