单细胞分析揭示了ZNF683在多发性骨髓瘤的NK细胞耗竭中的关键作用

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文章信息

文章题目：Single-cell transcriptome profiling reveals the key role of ZNF683 in natural killer cell exhaustion in multiple myeloma 发表期刊：Clin Transl Med 影响因子: 2区8.554 发表时间: 2022/10 DOI：https://doi.org/10.1002/ctm2.1065 研究领域：单细胞测序、NK细胞

概述

问题：在多发性骨髓瘤（MM）中 NK 细胞的细胞毒性降低。潜在的分子机制尚不清楚。

方法：对10例MM患者和3名健康志愿者的骨髓和外周血样本进行了单细胞RNA测序（Illumina Novaseq6000），鉴定NK细胞耗竭的关键调节因素。

结果和结论：将NK细胞分为七个不同的细胞亚群，其中一个ZNF683 NK cell有耗竭的表型以及相关的功能。研究结果揭示了ZNF683 NK细胞耗竭的重要机制，并表明转录因子ZNF683是MM免疫治疗中潜在的治疗靶点。

通过这个机制图可以看出，由于转录因子ZNF683的存在，SH2D1B的表达下调，也不能和SLAMF7结合，抑制了NK细胞的表型，表现为抑制性受体的上调，激活性受体的下调和细胞毒性功能的减弱。

结果

1. ZNF683 NK亚群在多发性骨髓瘤中富集

MM患者和健康个体之间免疫微环境的差异

对10名MM患者和3名健康志愿者的骨髓和外周血的单个核细胞进行了单细胞RNA测序。

总共241440个单细胞，分成13个单细胞亚群。主要包括T细胞，单核细胞/巨噬细胞，浆细胞，NK细胞和B细胞。

由于这篇文章主要是研究NK细胞，将 30008 个NK细胞进一步细分为七个亚群（0-6）。

healthy volunteers (Healthy_control, n = 3), MM patients before treatment (MM_Pre, n = 10), and after treatment (MM_Post, n = 9).

这里以我肉眼看来是 紫红色的那群细胞有一些变化。噢恕我眼拙，文中比较的不是 treatment，是健康control和MM的比较，也就是第1和第2个，第3个是对照？但紫红色在1和2里也挺明显的....还有蓝色（这都没有显著性么），但文中说是棕色就棕色吧。接下来重点研究这个有差异的棕色的ZNF683+NK亚群。

用Cellcall研究治疗前后的免疫微环境中C3与其他细胞成分（耗竭T细胞和浆细胞）之间的联系，在接受治疗后ZNF683 NK细胞与耗竭 CD8T细胞的细胞间通讯减少，表明抑制性免疫细胞之间的通讯在治疗过程中部分逆转（这里还说不准ZNF683 NK细胞是对治疗反应有利的细胞亚群、旁观免疫亚群还是助瘤细胞亚群）。

2. ZNF683 NK细胞在骨髓瘤中表现出细胞毒性相关标志物降低

MM患者和健康个体之间ZNF683 NK细胞的功能差异

来自MM患者的BM和PB中的 ZNF683 NK细胞的NK细胞毒性通路与来自健康志愿者的ZNF683 NK细胞相比显著下调（图中红色字体）。

三个细胞毒性基因包括SH2D1B，SYK和FCER1G在BM来源的ZNF683 NK细胞中相对于健康志愿者显著下调，在BM和PB样品中肿瘤坏死因子（TNF，CCL3，CCL4，XCL1和IL10）的表达显著低于大多数其他NK细胞簇的表达。

ZNF683 NK细胞表现出比大多数其他NK细胞簇更低的CD69，GNLY和GZMA的表达，细胞毒性评分也低于其他细胞簇。此外，患者来源的ZNF683 NK细胞中GZMA和GNLY的表达显著低于健康对照组的表达，GSEA也显示细胞凋亡相关基因在患者中高度富集。

总的来说，这些数据表明ZNF683 NK细胞在MM微环境中变得功能失调。

3. ZNF683 NK细胞在MM中表现出耗竭表型

除了上面提到的细胞毒性标志物外，还比较了MM患者ZNF683 NK细胞和其他NK细胞簇中的激活/抑制受体表达

来自MM患者的ZNF683 NK细胞表现出比其他NK细胞簇更高的NK细胞抑制标志物LAG3和KIR3DL2的表达（也没高多少啊...看不清，只能看清ZNF683，PTGDS）。

激活受体NCR1的表达，连同细胞毒性相关标志物PFN1，GNLY和FCER1G，在ZNF683 NK细胞中的表达比其他NK 细胞亚群明显下调。当然，患者BM和PM来源的NK细胞比对照组耗竭更严重，这里就不展开了，也是这些标志物。在ZNF683 NK细胞上表达的aNKR中，SLAMF7表达在患者和健康个体之间没有显著差异，但MM患者的ZNF683 NK细胞中几乎不存在SLAMF7的受体SH2D1B的表达。由于SH2D1B的缺失，SLAMF7可能无法在ZNF683 NK细胞中表现出激活功能。

NK功能障碍有三种形式：Exhaustion, anergy, and senescence。 anergy状态下的NK细胞是由4-1BB活化的衰减引起的，当NK细胞浸润在 MHCI 缺陷肿瘤中时，往往会发生这种情况。

除上述耗竭标志物外，还检测了ZNF683 NK细胞中另外两种标志物的表达。anergy状态下的NK细胞的特征是介导ADCC的标志物FCGR3A（CD16）和脱颗粒标志物LAMP1（CD107A）的表达减少，这里没有变化。同样，在患者和对照组之间，在衰老标志物B3GAT1（CD57）和KLRC1（NKG2A）的表达上也没有观察到显著差异。

所以不是这两种情况，猜测为耗竭状态。

验证耗竭状态：

MM来源的ZNF683 NK细胞中的耗竭标志物显著上调。ZNF683可能在NK细胞耗竭过程中起关键作用。

4. 转录因子ZNF683的转染促进耗竭且降低NK细胞的细胞毒性

ZNF683 NK细胞怎么表现为这种耗竭状态

与空载体（EV）转染的NK细胞相比，ZNF683转染显著诱导了抑制性受体LAG3，CTLA4，TIGIT和CD158b（KIR）的上调，以及激活受体NKG2D和NKp46（NCR）的下调。结果表明，ZNF683的转染在NK细胞中诱导了与耗竭相关的表型。

NK细胞怎么在MM中变化为耗竭的表型

CD56bright NK代表 immature NK cells；transitional NK 代表 中间过渡状态的NK细胞。ZNF683 NK细胞处于发育轨迹的末端阶段。

ZNF683的表达随着NK细胞耗竭逐渐上调，且抑制性受体LAG3，CST7和ITGB1等也上调，而SH2D1B和XBP1等激活相关基因下调，这也解释了为什么ZNF683 NK细胞和 transitional NK cells（簇6）具有相似的几个基因的表达模式，过渡NK细胞可能是耗竭前的细胞亚群。

ZNF683诱导NK细胞耗竭，那么ZNF683是否也抑制效应器功能呢？ZNF683转染NK细胞中的IFN-γ和穿孔素表达显著下调。细胞毒性测定也表明ZNF683是NK细胞毒性的主要调节因子。总之，ZNF683是进展为耗竭表型以及降低NK细胞毒性的驱动因素。

5. 敲低NK细胞中的ZNF683表达有助于逆转MM患者的NK细胞耗竭

探讨ZNF683下调对MM患者NK细胞表型和功能的影响

MM患者来源的NK细胞中的ZNF683表达显著高于来源于健康志愿者的表达。

与用空载体（EV）转染的NK细胞相比，ZNF683-shRNA载体（ZNF683-KD）敲低MM来源的NK细胞中的ZNF683表达中耗竭相关标记物LAG3，CTLA4，TIGIT和CD158b显著下调，而激活受体NKp46在ZNF683-KD NK细胞中反向上调。

IFN-γ和穿孔素在ZNF683-KD NK细胞中也显著上调。同时，与健康志愿者来源的NK细胞相比，细胞毒性测定显示MM来源的ZNF683 NK细胞的细胞毒性降低，而在MM患者的ZNF683-KD NK细胞中观察到NK细胞对靶细胞的细胞毒性增加，进一步证实了ZNF683过表达对MM中NK细胞表型和功能的不利影响。

6. SH2D1B作为NK细胞中ZNF683的直接靶标被下调

上文的拟时序分析可以看出随着ZNF683的表达逐渐升高，NK细胞逐渐趋于耗竭状态，SH2D1B的表达逐渐降低，假设ZNF683可能通过下调SH2D1B来驱动MM中的NK细胞耗竭。

SH2D1B表达与ZNF683表达呈显著负相关。

ZNF683是否通过直接结合其启动子区域来调节SH2D1B表达

通过JASPAR数据库（http://jaspar.genereg.net/）预测了SH2D1B上ZNF683结构域的结合位点。在编码链上得分为0.89的启动子区域之间得到了潜在的结合序列（GAGAAAGATAA），表明ZNF683与SH2D1B之间存在直接结合关系。双荧光素酶报告基因说明ZNF683转染SH2D1B报告基因的HEK293细胞比EV转染的细胞显示出显著更高的荧光素酶活性，表明转录因子ZNF683直接与SH2D1B的启动子结合。转染了ZNF683后显著降低了SH2D1B的表达。

总结

1. NK细胞的细胞毒性在MM免疫微环境中受损。NK细胞扩增是MM进展的结果还是抗肿瘤免疫反应的指征仍有待确认。
2. ZNF683诱导的SH2D1B下调促进ZNF683 NK细胞的耗竭并降低其细胞毒性，为MM中NK细胞的失调提供了新的见解，并为干扰NK细胞耗竭提供了重要线索。

番外

SLAMF7

SLAMF7的受体SH2D1B，但是由于SH2D1B的缺失，SLAMF7也不能发挥作用。

信号淋巴细胞激活分子家族成员7（SLAMF7）是表达于NK细胞和免疫细胞亚群的活化受体。最早研究发现其参与天然杀伤细胞(NK细胞)黏附功能。与正常浆细胞相比，多种免疫细胞包括NK细胞、NK样T细胞、CD8+T细胞、活化单核细胞及树突状细胞均低表达SLAMF7。抗体与SLAMF7结合可以激活NK细胞和固有免疫。活化NK细胞可直接杀死肿瘤细胞。通过SLAMF持续活化NK细胞可能激活适应性免疫，并产生长期免疫力。

去淘了张图，如果需要具体确证，还需要查更多文献啦~

在另一篇文中看到T细胞中ZNF683的高表达。

Transcription factor ZNF683 inhibits SIV/HIV replication through regulating IFNγ secretion of CD8+ T cells

ZNF683增加了CD8+ T细胞的增殖和IFN-γ的分泌能力，从而减少了SIV或HIV的复制，进一步抑制了微生物侵袭。

图1. 转录因子ZNF683在HIV-1感染中的抑制作用