著有 “玄学” 之称的分子生物学,师兄师姐说小 M 要做的都是 “升级打怪入门级” 的实验,然而,实验记录本上清晰地罗列着自己整理的堪称完美的 (假装看懂的 Steps) 实验流程,可是完美的流程下,总是充斥着不丝滑的操作——提 DNA,PCR,电泳,纯化回收,构载体;提 RNA,反转录,文库构建,qPCR……如何快速完成一套绝美的逆袭!!!
完美操作第一步
打好科研“地基”,从核酸提取开始
核酸是遗传信息的携带者,是基因表达的物质基础,是分子生物学研究的主要对象。如果要对核酸的结构和功能进行研究,首先就要对核酸进行提取和纯化。
核酸提取是个啥?字面意思,就是把核酸从样本中提取出来呗!
那一般常见的提取方法有哪些呢?
核酸提取主要包括细胞裂解、核酸吸附、杂质漂洗和核酸洗脱四步。那具体到实验中,我们该选择哪种提取方法呢?这就要看个人的实验设计方案及实验组的经费情况啦!
磁珠法提取效果当然很好,但贵是真的贵,而且还得购买配套的磁力架,批量提取的话,还是不太建议的!自配试剂的优缺点是显而易见的,若后续实验对核酸要求不高 (如常规的 DNA 提取,后续用做普通 PCR 扩增),这种提取方法也可选择。
但如果对核酸的质量要求比较高 (如定量或文库构建等。尤其不能忽略的是 RNA 提取中的降解和纯度问题),小 M 还是比较推荐受众度较高的离心柱法;至于质粒提取,考虑到纯度与浓度,肯定也选择这种性价比较高的离心柱法啦!
MCE 新推出三款核酸提取纯化试剂盒,均利用硅胶膜离心柱对核酸进行特异性吸附,改良的裂解液可以促进细胞充分裂解、蛋白变性、核酸释放;改良的吸附缓冲液能有效地促进核酸结合到硅胶膜上;最后经过洗脱即可获得高纯度核酸。
Kit one (基因组 DNA 小量抽提试剂盒):我适用于从动物组织/细胞、酵母、大肠杆菌等样本中有效提取并纯化基因组 DNA,内含 蛋白酶 K 可去除蛋白污染,经纯化的基因组 DNA 后续可用于 PCR、qPCR、酶切、Southern Blot 等实验。
Kit two (病毒 DNA/RNA 抽提试剂盒):我适用于从血浆、血清、全血、组织匀浆液、痰液、动物细胞上清等中提取病毒 DNA/RNA。我不仅包含 蛋白酶 K,更有核酸助沉剂助力,提取的核酸那可不团团来嘛!纯化的病毒 DNA/RNA 可用于 PCR、RT-PCR、qPCR 等实验。Kit three (质粒大量抽提试剂盒):我适用于从 ≤500 mL LB 培养基培养的大肠杆菌细胞中高效的提取质粒 DNA。RNase A 可对 RNA 进行清除,柱上去除内毒素,Very good!MCE 新上线核酸提取试剂盒 (离心柱型),尝鲜试用装,抓紧时间领取吧!
产品名称 | 免费试用装链接 |
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Genomic DNA Mini Purification Kit | Free Sample |
Viral DNA/RNA Mini Purification Kit | Free Sample |
Plasmid DNA Maxi Purification Kit | Free Sample |
完美操作第二步
避开操作“雷区”,拿到高纯度核酸
小M:Protocol 很完美,实际操作过程中,也难免会遇到各种小问题。
下面小 M 对 RNA 提取过程中常见问题进行了一一盘点。
(此处主要针对 RNA 提取,文末彩蛋有 DNA 和质粒提取注意事项汇总哦)。RNA 提取后续试验主要包括 PCR、RT-PCR、qPCR、cDNA 文库构建等,RNA 没提好,后面的实验问题也是连贯性的,一个不小心可就都 game over 了。这个 RNA 提取,真的是……脑壳疼!
来来来,这道题,我们重点讲一下。
影响 RNA 得率低的因素很多?抽提 RNA,当然要做到 “三从四德”。
一从:外源酶污染?NO!
二从:内源酶活性?NO!
三从:抽提目的性?YES!
一德:使用无 RNase 耗材,选择合适的操作环境。
二德:确定样本后选择合适的裂解液,样本与裂解程度不匹配,抽提结果也会大打折扣。
三德:裂解、匀浆、抽提、洗脱——快!准!狠!
四德:衡量抽提性价比的标准是后续实验的结果,得率不是仅有的标准。即我们需要明确下一步的实验,如果是 PCR,其实验本身对 RNA 的质量要求没有那么高,而 qPCR 对 RNA 的要求相对又高点,但如果要做 cDNA 文库构建,其对 RNA 的要求就很高了,因此 RNA 质量便是 “经济基础” 了,颇有 “一损俱损” 的感觉了。
小白: “三从四德” 我也懂,但 RNA 得率这么低具体是为什么呢?
小M:还不是因为 RNA 太娇贵,放太久会降解,环境不干净会降解,吹口气也能降解~
彩蛋时间到!!!
(含 DNA 和质粒提取注意事项)
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