RNA-seq 详细教程：实验设计（2）

学习目标

• 了解设置重复对于 RNA-seq 分析的重要性
• 了解生物重复次数、测序深度和鉴定到的差异表达基因之间的关系
• 了解如何设计RNA-seq 实验，以避免批次效应

1. 注意事项

了解 RNA 提取和 RNA-seq 文库制备实验过程中的步骤，有助于设计 RNA-seq 实验，但有一些特殊的注意事项需要明确：

1. 重复次数和类型
2. 避免混淆
3. 处理批次效应

2. 重复

实验重复可以通过技术重复或生物学重复来实现，如下图：

[Klaus B., EMBO J (2015) 34: 2727-2730](https://dx.doi.org/10.15252%2Fembj.201592958)

• 技术重复

使用相同的生物样本重复实验步骤，以准确测量技术差异并在分析过程中将其去除。

• 生物学重复

使用相同条件下的不同生物样本来衡量样本间的差异。

在微阵列时代，技术重复被认为是必要的；然而，当前的 RNA-seq 技术，技术差异远低于生物差异，因此不需要技术重复。相反，生物重复对于差异表达分析是绝对必要的。

对于差异表达分析，生物学重复越多，对生物学变异的估计就越好，我们对平均表达水平的估计也就越精确。因此，数据可以进行更准确的建模并识别更多差异表达的基因。

[Liu, Y., et al., Bioinformatics (2014) 30(3): 301–304](https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt688)

如上图所示，生物重复比测序深度更重要，测序深度是每个样本测序的读数总数。该图显示了测序深度和重复次数对鉴定出的差异表达基因数的关系。与增加测序深度相比，重复次数的增加往往会得到更多的差异表达基因。因此，通常更多的重复比更高的测序深度更好，但需要注意的是，检测低表达的差异表达基因和执行异构体水平（可变剪切）的差异表达分析需要更高的深度。

下面列出了一些关于重复和测序深度的建议，用于实验规划：

• 通用建议：
  • ENCODE 建议每个样本有 3000 万个 SE reads。
  • 如果有大量的重复 (>3)，每个样本 1500 万次 reads 通常就足够了。
  • 如果可能，进行更多的生物重复。
  • 通常建议读取长度 >= 50 bp
• 含有低表达基因：
  • 同样，重复比测序深度更有作用。
  • 深度更深，至少有 30-60 百万 reads ，具体取决于表达水平。
• 异构体水平的差异表达：
  • 新亚型的深度应该更大（每个样本 > 6000 万 reads）。
  • 对 RNA 质量进行质控。
• 其他类型的 RNA 分析（内含子保留、small RNA-Seq 等）：
  • 取绝于具体的分析

总之，尽量做生物学重复。

3. Confound

Confounding 是指：无法区分结果是由什么原因导致的。

例如，我们知道性别对基因表达有很大影响，如果我们所有的对照组小鼠都是雌性而所有处理组小鼠都是雄性，那么我们的治疗效果就会被性别混淆。我们无法区分是处理的作用和性别的作用。

• 如何避免：

1. 如果可能，确保每种情况下的动物都是相同的性别、年龄和批次。
2. 如果不可能，则确保在不同条件下平均分配动物。

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4. 批次效应

批次效应是 RNA-seq 分析的一个重要问题，仅由批次效应就能导致显著的表达差异。

[Hicks SC, et al., bioRxiv (2015)](https://www.biorxiv.org/content/early/2015/08/25/025528)

• 如何确定是否有批次效应

1. 是否所有的 RNA 提取都是在同一天进行的？
2. 是否所有的文库构建都是在同一天进行的？
3. 是否同一个人对所有样品进行了 RNA 提取与文库制备？
4. 是否对所有样品使用了相同的试剂？
5. 是否在同一地点进行 RNA 提取与文库制备？

如果任何一个答案是“否”，那么就存在批次效应。

5. 建议

• 如果可能，以避免分批的方式设计实验。
• 如果无法避免分批：

1. 不要按批次混淆实验：

[Hicks SC, et al., bioRxiv (2015)](https://www.biorxiv.org/content/early/2015/08/25/025528)

1. 跨批次拆分不同样本组的重复。重复次数越多越好（超过 2 个）。

[Hicks SC, et al., bioRxiv (2015)](https://www.biorxiv.org/content/early/2015/08/25/025528)

1. 请务必在实验数据中包含批次信息。在分析过程中，如果没有混淆，可以回归出由于批次引起的变异，所以有这些信息，它不会影响结果。