复杂组织中单细胞表观基因组的空间分辨方法
前言
题目：Spatially resolved epigenomic profiling of single cells in complex tissues 日期：2022-11-10 期刊：Cell DOI：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.09.035
摘要
表观基因组中编码的调控信息，如组蛋白和DNA修饰，能够在发育过程中差异激活或抑制基因以产生不同的细胞类型。最近，表观遗传测序技术已扩展到单细胞水平，能够分析单个细胞中的染色质可及性和表观遗传修饰。但是在需要细胞解离的基于测序的方法中，细胞的空间背景丢失了。而这部分空间信息对于研究表观基因如何在复杂组织的自然环境中调控细胞类型的发展以及细胞的状态至关重要。
近年来已开发了多种方法分析转录组的空间组学，包括包括基于成像的多重荧光原位杂交FISH和原位测序in situ sequencing，以及带有空间信息的RNA捕获转录测序。然而，由于成像分辨率有限, 对于大多数 ~1 kb 或更短的基因调控元件，表观遗传状态的成像仍然具有挑战性。
作者开发了epigenomic MERFISH的方法，使用抗体标记表观遗传修饰，然后抗体去结合带有转座酶Tn5的蛋白A（PA-Tn5），这样Tn5就能够将T7启动子和测序引物带到表观遗传修饰位点或其附近的DNA区域。
T7启动子可以通过T7聚合酶，将修饰位点DNA转录成RNA。整个转录过程中样品被嵌入聚丙烯酰胺凝胶中，并用蛋白酶K消化去除可能阻碍T7转录的DNA互作蛋白，从而增加转录效率。最后，使用多重容错荧光原位杂交MERFISH将样品中的RNA成像。
成年小鼠大脑皮层启动子区域的空间解析
为了展示了该方法的空间解析能力，作者对成年小鼠大脑体感皮层约~4200个单细胞中的127个位点进行了成像。
在检测到的127个H3K4me3启动子位点中，有38个启动子位点在RNA MERFISH数据中具有相应的基因。epigenomic MERFISH检测的Cux2和Unc5d启动子H3K4me3的信号在第II/III和IV层中较强；第四层主要是Rorb和Slc17a6启动子H3K4me3；Fezf2启动子H3K4me3的信号在V和VI层中较强；Foxp2启动子H3K4me3的信号在层VI中较强。
小鼠胚胎大脑活性启动子的空间解析
之后作者绘制了127个靶基因座H3K4me3信号在胚胎大脑中的分布，划定了五个大脑区域（皮质、小脑下、间脑、中脑和后脑），并且在每一个区域都去检测127个基因座的密度（ spot density）。热图发现了一些特定区域富集的基因座。为了进一步验证，作者选取了密度相当高（>300个点/mm2）的基因座，并且将它们的空间分布和已发表的Allen brain in situ hybridization (ISH) atlas (Lein et al., 2007)图谱进行比较。发现许多基因座的H3K4me3信号的空间分布，和已发表的表达模式相似。例如，Tbr1和Fezf2的启动子在皮质内主要表现H3K4me3信号，与RNA ISH图像中的Tbr1与Fezf2表达模式类似；皮质发育的典型转录因子Emx1、Emx2和Eomes也富集H3K4me3信号；作为端脑标记物，Foxg1在皮质和小脑下富集H3K4me3信号，这个和预期相符。
成年小鼠大脑皮层特异性增强子的空间解析
首先通过靶向H3K27ac修饰的基因组位点来分析皮层特异性的增强子。选择了距离已知基因TSS＞2 kb的139个ATAC峰，针对H3K27ac修饰对这些基因座进行了epigenomic MERFISH成像，并对该区域的5400个体细胞进行了分析。在139个目标基因座中，有35个表现了显著的皮层特异性。
另外，一些潜在的增强子基因座中表现了H3K27ac信号的皮层特异性，并且与邻近基因的空间表达模式相似。例如，基因Unc5d的TSS 600 kb内的三个潜在增强子基因座（基因座123、124和127）在II/III层和IV层中表现出比较一致的表达模式，而Unc5d基因也在II/Ⅲ和IV层中也是高表达。小鼠大脑的Hi-C数据表明，这三个基因座和Unc5d基因位于同一染色质拓扑结构域内。表明了基因座123、124和127是Unc5d基因的潜在增强子。
