分子生物学实验技术——荧光素酶实验

🔶报告基因/报告基团（reporter）：是一种可被实验仪器非常方便检测到的化学基团、蛋白质或酶以及编码它们的基因。reporter可以通过实验手段非常容易被鉴定与检测，因此在实验中广泛应用。

例如，荧光素酶报告基因实验中运用的荧光素酶基因，以及qPCR中的荧光报告基团。

🤩报告基因是现代分子生物学研究领域中用于潜在的顺式元件和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具，被广泛应用于基因表达调控、信号转导、启动子分析、受体功能鉴定、基因治疗以及药物筛选等领域。

一、荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）

转录因子的 DNA 结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的调控作用。荧光素酶报告基因实验就是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

💫荧光素酶（Luciferase）：是能够催化底物氧化发光的一类酶的统称。

荧光素酶的种类很多，其中应用较为广泛的是萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，FLUC）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，RLUC）

💫在ATP、Mg2+、O2存在的条件下，虫荧光素在虫荧光素酶的催化下氧化发光，发光颜色为黄绿色。

Luciferase报告基因系统是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin被氧化成oxyluciferin的反应，在luciferin被氧化的过程中会发出生物荧光，然后可以通过仪器测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。

例如，我们想要研究某个转录因子是否能与某一靶启动子片段有作用。

1️⃣在质粒中，将靶启动子（或其他要研究的基因调控元件）插入到荧光素酶报告基因前方，构建成报告基因质粒。🔄

2️⃣ 将可以表达要检测的转录因子的质粒与报告基因质粒共转染细胞，如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

3️⃣加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光🤩，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

🏹同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等)对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因(Rinilla luciferase 的质粒(pRL-TK)作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

✅荧光素酶报告基因的优点

1. 蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性。
2. 在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光。
3. 高效，检测快速，每个样品只需几秒钟。

二、双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase reporter assay）

🏹Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者可催化各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，以萤火虫萤光素酶为核心reporter，海肾荧光素酶作为内参，构建研究对象到相应位置，转染细胞，裂解细胞，分别加荧光素酶底物，用荧光测定仪检测荧光强度，通过数据得出基因表达量，从而确定构建序列的功能。双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。

🔬将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，以研究启动子的强弱或转录因子对启动子的作用。与此同时，引入包含Renilla luciferase基因的TK载体作为内参，以便消除细胞转染等因素带来的组间误差。

双荧光素酶报告基因检测系统中的luciferase来源于细菌、萤火虫、发光海洋生物等，可以在哺乳细胞中直接表达，无需表达后修饰，直接具备完全酶活性。与绿色荧光蛋白（GFP）不同，它们的发光检测不需要激发光激发，且发光穿透力更强，这使其具备可定量、高灵敏度及低背景等特点

海肾荧光素酶催化的发光反应需要腔肠素和O2的参与，发光颜色为蓝色。

✅海肾荧光素酶通常作为内参报告基因，在实验操作的过程中，常遇到由于个人操作造成的实验误差，比如细胞数目不均一、细胞代次不统一、转染效率不一致等。引入一个内参报告基因，以此来标定检测用报告基因的测量结果，从而达到有效地减少实验误差的目的

三、绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein， GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。

2008年10月8日，日本科学家下村修、美国科学家马丁·查尔菲和钱永健因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖。

在细胞生物学与分子生物学中，GFP基因常用做报告基因(reporter gene)。

✅与传统荧光染料相比，GFP的主要优势在于它无毒，并且可以在活细胞中表达，从而可以研究动态的生理过程。

🔬【应用】

1. 融合标记：GFP是最常见的用途之一，它可以与蛋白质的N-或C-末端融合，这使科学家能够可视化基因表达的时间和地点。
2. Reporter：将GFP置于感兴趣的启动子的控制下，可以用来有效地监测特定细胞类型中启动子的基因表达。这种转录报告是GFP最早的应用之一。
3. 纯化：GFP可作为蛋白质纯化的一般表位标记，并可获得大量的GFP商业抗体。
4. 其他：它还被用于在药物筛选中识别特定细胞群，在癌症研究中可视化裸鼠的微转移，充当DNA双链断裂修复的报告员，并标记致病性细胞内微生物，以可视化宿主/病原体相互作用。