一、什么是空间转录组?
空间转录组,也称为 spatial gene expression,简称 ST-seq,是将转录组学,单细胞测序技术以及组织切片技术结合起来的技术。
传统的转录组可以得到基因的差异表达信息,单细胞转录组提供了更高分辨率的基因表达信息,可以分辨出不同细胞的类型,而空间转录组在此基础之上,还可以得到不同类型细胞的空间分布信息,分辨率进一步提高。
样品切片信息
切片+单细胞得到的空间转录组
二、为什么要做空间转录组?
空间转录组将组织切片与转录组测序结合,实现空间信息和转录本信息的获取。相比于单细胞转录组提供了空间信息,这样可以更好的去分辩单细胞的信息。可以用于肿瘤研究中,更好的区分癌细胞与正常细胞。
三、10x genomics 空间转录组
10x genomics 的空间转录组产品成为 Visium,可以用于新鲜冷冻组织样品以及 FFPE 组织样品,在其官网上有非常详细的文档材料。
介绍 https://www.10xgenomics.com/cn/products/spatial-gene-expression
Visium 空间基因表达解决方案能够检测完整组织切片中的全转录组或一组指定的转录本,并定位基因活性发生的位置。通过全转录组分析,您能够探索并揭示细胞类型、细胞状态和生物标志物的空间排布。
通过我们预先设计的肿瘤学、免疫学或神经科学靶向基因组合,您还可以关注感兴趣的特定基因或通路。再结合免疫荧光,您就能同时观察蛋白质和基因表达。Visium 空间基因表达解决方案将空间转录组学技术轻松融入标准的组织切片以及 H&E 染色或免疫荧光染色方法中。现在,您终于可以在同一个样本中,通过简单的、互补的工作流程,从 RNA、蛋白质和形态学的角度对组织切片进行全方位分析。
四、空间转录组建库
由于空间转录组相比于单细胞转录组多了空间信息,因此 10X Visium 的实验可以分为两个板块——组织学板块和组学板块。组织学板块包括样品的包埋、切片、固定、染色及成像,记录切片的形态学信息;组学板块包括 cDNA 的合成、扩增、接头连接和测序,记录切片的转录本信息和空间位置信息。
10x Visium 建库测序又分为新鲜冷冻组织与 FFPE 组织两种类型。
4.1 10x Visium 芯片
10x Visium 使用特制的玻片,玻片上有捕获区域(capture area),捕获区域是一个 6.5*6.5mm的正方形区域,每个捕获区域包含约 5000 个 spot,每个 spot 上结合有捕获序列,捕获序列有barcode序列记录spot 位置信息和 poly(dT)序列结合 mRNA的poly(A)尾,在捕获mRNA的同时也保留了 mRNA 的位置信息。转录本的位置信息结合染色拍照结果即可还原转录本在组织的位置分布。
10x Visium 芯片示意图
空间转录组文库
4.2 新鲜冷冻组织建库
通过易于使用的强大工作流程简化实验,以进行整张组织切片的分析。
对新鲜冷冻的组织进行切片,放置在文库制备玻片上进行固定,然后进行 H&E 或免疫荧光染色并成像,接着透化处理释放 mRNA,让其与带有空间条形码的捕获探针结合,以便捕获基因表达信息。
用捕获的 mRNA 合成 cDNA,然后从玻片上洗脱,进行测序文库的构建。对全转录组或靶向基因表达文库进行测序,并通过易用的数据分析和可视化软件 Space Ranger 和 Loupe Browser 来开展数据分析和可视化。Loupe Browser 能够将基因表达数据与组织学或免疫荧光蛋白数据进行直接比较。从样本到可用于测序的文库,整个流程可在一天内完成。
4.3 FFPE 样品
通过功能强大且立即可用的工作流程,轻松实现从 FFPE 组织块样本到数据的全转录组分析。
A. 将 FFPE 组织切片放置在 Visium 基因表达玻片上,并进行组织学成像(通过 H&E 染色获得形态背景,或通过 IF 实现蛋白质共检测)。Visium FFPE 玻片上的每个捕获区都有一个阵列,其中含有与 RNA 结合的捕获探针。延长探针对以加入空间条形码,并制备测序文库。之后对文库进行测序,并对数据进行可视化,确定哪些基因表达,在何处表达以及表达量多少。
B. Visium FFPE 采用 RNA 模板连接(RTL),它将特异针对蛋白编码转录组中基因的探针对与其基因靶点杂交,然后彼此连接。对组织进行透化处理,以释放连接的探针对,使其与玻片上的捕获探针杂交,从而实现基因表达信息的捕获。
视频:
https://www.10xgenomics.com/videos/34qaw3242t?autoplay=true
https://www.10xgenomics.com/videos/fvc5ujvp1a?autoplay=true
五、空间转录组数据分析
空间转录组分析流程
案例:
https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/pipelines/latest/tutorials/count-ff-tutorial
5.1 下载数据
# Create datasets folder
mkdir datasets
# Download FASTQ to datasets folder
wget -P datasets/ https://s3-us-west-2.amazonaws.com/10x.files/samples/spatial-exp/1.1.0/V1_Adult_Mouse_Brain/V1_Adult_Mouse_Brain_fastqs.tar
# Download image file to datasets folder
wget -P datasets/ https://cf.10xgenomics.com/samples/spatial-exp/1.1.0/V1_Adult_Mouse_Brain/V1_Adult_Mouse_Brain_image.tif
5.2 下载参考序列
# Download mouse reference
curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/spatial-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
5.3 下载 SpaceRanger 和 Loupe Browser
wget -O spaceranger-2.0.0.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/spatial-exp/spaceranger-2.0.0.tar.gz?Expires=1665629587&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cHM6Ly9jZi4xMHhnZW5vbWljcy5jb20vcmVsZWFzZXMvc3BhdGlhbC1leHAvc3BhY2VyYW5nZXItMi4wLjAudGFyLmd6IiwiQ29uZGl0aW9uIjp7IkRhdGVMZXNzVGhhbiI6eyJBV1M6RXBvY2hUaW1lIjoxNjY1NjI5NTg3fX19XX0_&Signature=WS9WzeIKOXSv8bLu3tKQ4XiJB9QBP5QkDmnzwCCAIzf2kb9fyfIqYO1xIjjS2hE6BKf-ncBQtUjDS00Lj8io95YCbwMjOFuudiixRwCxTyIPFTC1p-~-710rRUCP1yM3SV-u65JSyR4mYpNtV~v~y~MwM0hNCSOhgnKnTwyfcIhg7GiCt5H6gYUiP0wBJFPSYNr5PCydNDJW5AsJF-CtvzIPWQaypCh8DgNEeAnFXm5tn8kO~BWk0orrzFBV3f~bRxvzqXlnmm1MzOvsi1oxCCWwTEt2q4ik1zqXdGTkr5wpBYVccDqHj2jcjhEIB3mGl00XSL~AaFztUY9ACb7czA__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"
5.4 spaceranger 数据处理
~/biosoft/spaceranger-2.0.0/bin/spaceranger count --id="V1_Adult_Mouse_Brain" \
--description="Adult Mouse Brain(Coronal)" --area=C1 \
--transcriptome=/share/home/xiehs/16.rscrna/stseq/ref/refdata-gex-mm10-2020-A/ \
--slide=V19L01-041 \
--fastqs=/share/home/xiehs/16.rscrna/stseq/datasets/V1_Adult_Mouse_Brain_fastqs \
--image=/share/home/xiehs/16.rscrna/stseq/datasets/V1_Adult_Mouse_Brain_image.tif --localcores=16 --localmem=32
#无法联网添加选项 :--slidefile=V19L01-041.gpr
gpr 文件下载地址:
https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/pipelines/latest/using/slidefile-download
5.5 空间转录组结果解读
Space Ranger 分析结果文件
5.6 Loupe Browser 可视化结果
将 Space Ranger 分析结果中的 cloupe.cloupe 文件导入 Loupe Browser 进行结果可视化。
利用 Loupe Browser 可视化空间转录组结果
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